[发明专利]改良型腈水合酶

说明书

本申请为下述申请的分案申请。 

发明名称：改良型腈水合酶 

申请日：2005年5月26日 

申请号：200580016665.0(PCT/JP2005/010107) 

技术领域

本发明涉及具有耐热性提高或底物特异性改变的改良型腈水合酶活性的蛋白质；编码该蛋白质的基因DNA；具有该基因DNA的重组载体；具有该重组载体的转化体或转导体；提取自该转化体或转导体培养物的腈水合酶及其制备方法；以及使用了该培养物或该处理物的酰胺化合物的制备方法。 

背景技术

近年来，人们发现了具有腈水合活性的酶——腈水合酶，该酶可通过水合作用将腈基转换为酰胺基，并且公开了利用该酶或具有该酶的微生物菌体以腈化合物制备对应的酰胺化合物的方法。与以往的化学合成方法相比，这种制备方法因具有高度的由腈化合物转化成对应的酰胺化合物的转化率和选择率而为人所知。 

生产腈水合酶的微生物，可列举例如属于棒杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、根瘤菌属(Rhizobium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假诺卡氏属(Pseudonocardia)等的微生物。其中玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)J-1株已用于丙烯酰胺的工业生产，其有效性已被证实。另外，编码生产该菌株的腈水合酶的基因也已查明(请参考专利文献1)。从降低反应时酶的用量和降低成本的观点出发，期待能获取耐热性进一步提高的酶。 

另一方面，不仅是利用从自然界存在的微生物离析得到的腈水合酶或其基因，出于改变腈水合酶的活性、底物特异性、Vmax、Km、热稳定性、底物稳定性、产物稳定性等目的，人们尝试对腈水合酶引入突变。(参考专利文献2和3) 

专利文献1：特许第3162091号公报 

专利文献2：国际公开2004/056990号手册(pamphlet) 

专利文献3：特开2004-222538号公报 

发明内容

腈水合酶是已用于丙烯酰胺工业生产的酶，但获取耐热性等性质较目前所使用的酶进一步提高的酶可降低酶反应时的成本。 

因此，本发明的目的在于进一步改良腈水合酶，提供耐热性更为提高的具有腈水合酶活性的蛋白质，编码该蛋白质的基因DNA，具有该基因DNA的重组载体，具有该重组载体的转化体或转导体，提取自该转化体或转导体培养物的腈水合酶及其制备方法以及使用了该培养物或处理物的酰胺化合物的制备方法。 

另外，玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)J-1株的腈水合酶虽然已用于以丙烯腈为原料的丙烯酰胺的工业生产，但对于芳香腈反应活性低，在期待开发出对于芳香腈反应活性高的酶的同时，从降低催化剂成本的观点出发，也期待开发出热稳定、不易失活的酶。因此，本发明以改良腈水合酶获得耐热性提高的酶以及/或者获得对芳香腈反应活性提高的酶为目的。 

本发明人为解决上述课题经过深入研究，发现在来源于玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)J-1株的腈水合酶的氨基酸序列中，通过将其中至少一个以上的氨基酸残基用选自天然氨基酸组的残基取代，该酶耐热性得以提高以及/或者对芳香腈的反应活性得以提高，从而完成了本发明。即，本发明如下所述： 

(1)一种蛋白质，是野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列上第93位谷氨酸残基被其他氨基酸残基取代并且具有耐热性腈水合酶活性的蛋白质，所述其他氨基酸残基是选自甘氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及酪氨酸中的任意一个氨基酸残基，所述野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列如SEDID NO：2所示。 

(2)上述(1)中所述的蛋白质，进一步地，β亚基的第103位谷氨酸残基被天冬氨酸残基取代。 

(3)上述(1)中所述的蛋白质，进一步地，野生型腈水合酶的α亚基的氨基酸序列上，第132位天冬氨酸残基被天冬酰胺残基取代，所述野生型腈水合酶的α亚基的氨基酸序列如SED ID NO：4所示。 

(4)一种DNA，编码上述(1)-(3)中任意一项所述的蛋白质。 

(5)一种重组载体，含有上述(4)所述的DNA。 

(6)一种转化体，含有上述(5)所述的重组载体。 

(7)一种制备腈水合酶的方法，其特征在于，培养上述(6)所述的转化体，从所得培养物提取腈水合酶。