[发明专利]一种制备高温稳定的包含氧载体的药物组合物的方法及其应用

权利要求书

1.一种制备高度纯化的和高温稳定的包含氧载体的药物组合物的方法，所述包含氧载体的药物组合物包含血红蛋白，所述方法包括：

a)提供至少包含红细胞和血浆的哺乳动物全血；

b)将所述哺乳动物全血中的红细胞与血浆分离；

c)过滤与血浆分离的红细胞从而获得滤过的红细胞级分；

d)洗涤所述滤过的红细胞级分从而去除血浆蛋白杂质，得到洗涤过的红细胞；

e)在快速细胞裂解设备中，通过可控的低渗裂解以50-1000升/小时的流速来破裂所述洗涤过的红细胞，持续足以裂解红细胞却不裂解白细胞的时间，从而形成包含破裂的红细胞的裂解产物的溶液；

f)进行过滤以从所述裂解产物中去除至少部分废截留物；

g)从所述裂解产物提取第一血红蛋白溶液；

h)使用超滤滤器进行第一超滤过程，所述超滤滤器被配置成去除分子量比四聚体血红蛋白高的杂质，以从第一血红蛋白溶液中进一步去除任何病毒和残留废截留物，从而获得第二血红蛋白溶液；

i)对所述第二血红蛋白溶液进行流通柱色谱以去除磷脂、蛋白杂质和二聚体血红蛋白并形成无磷脂、低蛋白杂质和低二聚体血红蛋白的溶液；

j)使用被配置成去除杂质的滤器对所述无磷脂、低蛋白杂质和低二聚体血红蛋白的溶液进行第二超滤过程，产生浓缩纯化的无磷脂、低蛋白杂质和低二聚体血红蛋白的溶液；

k)在充分氧合的环境中通过巯基试剂封闭所述浓缩纯化的无磷脂、低蛋白杂质和低二聚体血红蛋白的溶液中血红蛋白分子的巯基使得各血红蛋白分子具有至少一个包含巯基保护基团的半胱氨酸部分，使得所述血红蛋白分子不能在所述半胱氨酸位点处结合内皮衍生舒张因子；

1)通过富马酸二-3，5-二溴水杨酸酯交联所述巯基保护的血红蛋白，从而形成高温稳定的交联四聚体血红蛋白而不形成聚合血红蛋白，使得得到的交联四聚体血红蛋白的分子量为60-70kDa，并且基本上由未聚合的交联四聚体血红蛋白组成；

m)用合适的生理缓冲液交换所述交联四聚体血红蛋白；

n)通过洗涤去除任何残留的未交联的四聚体血红蛋白和任何残留的化学物质；

o)向所述交联四聚体血红蛋白加入浓度为0.2-0.4％的N-乙酰半胱氨酸从而将高铁血红蛋白的水平保持在5％以下；和

p)将所述低二聚体、无磷脂、巯基保护的在高达80℃的温度下高温稳定的不含聚合血红蛋白的交联四聚体血红蛋白加入药学可接受的载体。

2.根据权利要求1所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，其中所述快速细胞裂解设备包括静态混合器。

3.根据权利要求1所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，其中所述交联四聚体血红蛋白衍生自牛、猪、犬或马血红蛋白。

4.根据权利要求1所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，其中所述柱色谱包含一个或多个阳离子交换柱和阴离子交换柱。

5.根据权利要求4所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，其中所述离子交换柱为一个或多个DEAE柱、CM柱和/或羟磷灰石柱。

6.根据权利要求1所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，其中通过富马酸二-3，5-二溴水杨酸酯的血红蛋白交联包括至少α-α和/或β-β交联。

7.根据权利要求6所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，其中选择交联条件使得β-β交联大于总交联的50％。

8.根据权利要求6所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，其中选择交联条件使得β-β交联大于总交联的60％。

9.根据权利要求6所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，其中选择交联条件使得β-β交联大于总交联的70％。

10.根据权利要求1所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，其中所述药学可接受的载体为生理缓冲液或水。

11.根据权利要求1所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，所述方法还包括将已制备的组合物包装在多层柔性输液包装中，所述输液包装在日常环境条件下的透氧性为每24小时小于0.0025cm³。

12.一种高度纯化和高温稳定的包含氧载体的药物组合物，所述药物组合物包含血红蛋白，所述血红蛋白由通过权利要求1所述的方法形成的未聚合的交联四聚体血红蛋白组成。