[发明专利]一种用于快速检测华法林个体化用药相关基因SNP位点的试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种能用于快速检测华法林个体化用药相关基因SNP位点的方法，具体说是通过抽取人外周血DNA，通过Taq man探针特异性PCR扩增后进行荧光信号分析，对CYP2C9*3（1061A/C）和VKORC1（-1639G/A）两个多态性位点进行快速精确基因分型。该方法可以用于临床需要服用华法林的各类患者的辅助诊断、治疗，属于生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术。

背景技术

华法林是目前广泛应用的香豆素类口服抗凝药，用于预防和治疗血栓栓塞性疾病如：人工瓣膜置换、静脉血栓形成(肺栓塞)、房颤等的口服抗凝治疗，以及降低心肌梗死复发及心肌梗死后血栓栓塞死亡的危险。但是华法林的剂量很难掌握，因为不同病人的所需用量可以相差十倍以上。目前，CYP2C9和维生素K环氧化物还原酶(VKOR)基因多态性对华法林代谢的影响逐渐被认识，其中CYP2C9*3（1061A/C）和VKORC1（-1639G/A）与华法林关系最为密切，都与代谢酶的损伤有关，从而导致个体间和民族间华法林用量的差异。因此，临床上一种快速准确的基因分型方法的应用将对需华法林治疗的患者提供个体化的医疗方案。

现在已经证实有30多种基因相互作用决定华法林代谢、转运和药理作用。患者不同的药物基因组学信息是导致华法林剂量差异的重要因素。与遗传因素相关的低凝血酶原患者最常见的原因是CYP2C9代谢活性降低和药物靶标VKORC1（vitamin K epoxide reductase complex1）低表达。这两种基因的遗传多态性在全世界范围内可解释15%和25％的华法林剂量变异。有研究显示基于这两种基因多态性的华法林使用剂量能够有效的减少不良事件的发生和血栓性疾病的预防[1,2]。因此美国FDA在2007年修改了华法林的使用说明，建议在使用华法林前进行基因分型。而且CYP2C9、VKORC1基因多态性分析已经成为国内外有条件的临床实验室重要检测项目。

目前检测CYP2C9*3（1061A/C）和VKORC1（-1639G/A）遗传多态性的最简单的方法是PCR-RFLP，其主要原理是通过应用特异性限制性内切酶消化PCR扩增产物，并根据消化位点是否消失来判断其变异存在与否。但该方法操作复杂，样本量多时易造成PCR产物的交叉污染且容易出现酶切不充分或酶切过度而出现假阴性或假阳性结果，可靠性低。荧光定量PCR和多重PCR方法尽管特异性有所提高，但是这两种方法的原理仍然是基于普通PCR的原理，荧光信号的强弱，引物特异性以及低保真Taq酶等这些因素均可造成对结果的影响。DNA测序法价格相对昂贵且操作流程繁琐，在人类后基因组时代突飞猛进的今天，这几种方法均不能满足当前对VKORC1(-1639G/A)和CYP2C9(1075A/C)SNP位点快速准确分析的要求。

Taqman探针的方法采用特异性的荧光标记的探针，特异性强，灵敏度高且操作方便，快速。该方法同样被认为是SNP分型的金标准，在临床应用的前景值得期待。其基本原理是：应用一对双荧光标记的Taqman探针，分别针对双等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探针扩增出各自的基因型；用两种荧光染料FAM,HEX(VIC)分别标记这两种探针，就可以在一次PCR反应中完成对单个SNP位点的基因型判定。所以该方法中引物长度，探针长度，引物特异性，探针特异性对检测结果的特异性和敏感性非常重要。

发明内容

本发明要解决的首要技术问题是提供一种能快速精确进行华法林个体化用药相关SNP位点基因分型的方法。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种快速能精确进行华法林个体化用药相关SNP位点基因分型的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种能快速精确进行华法林个体化用药相关SNP位点基因分型的方法，该方法通过提取人的外周血白细胞基因组DNA，采用Taqman探针的方法测定受试者的CYP2C9*3（1061A/C）和VKORC1（-1639G/A）两个位点的基因型。

一组能快速精确进行华法林个体化用药相关SNP位点基因分型的引物，该引物能特异性的扩增出CYP2C9*3（1061A/C）和VKORC1（-1639G/A）位点的扩增产物，

一组能快速精确进行华法林个体化用药相关SNP位点基因分型的探针，该探针能特异性的结合在目的片段，通过PCR扩增实现荧光信号的倍增。其核心是利用Taq酶的3’-5’外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。