[发明专利]尖吻蝮蛇血凝酶-C

权利要求书

1.尖吻蝮蛇血凝酶-C，该酶由α、β两个亚基构成，其中α亚基具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；β亚基具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

2.含有权利要求1所述尖吻蝮蛇血凝酶的药物。

3.如权利要求2所述的药物，其为冻干粉、止血贴剂或液体喷雾剂。

4.权利要求1所述血凝酶-C的纯化方法，其包括如下步骤：

1）、蛇毒经硫酸铵分级沉淀预处理；

2）、将预处理后的蛇毒溶液上经预平衡的DEAE－Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱，用0.01M pH7.0～7.5的PBS洗柱，再用含0.02M和0.06M NaCl的0.01M pH7.0～7.5的PBS分段洗脱，收集0.06M NaCl溶液的第一个洗脱峰；

3）、将上述洗脱液适当浓缩后透析或经反复稀释超滤浓缩去除NaCl；

4）、将透析后的溶液再次上经预平衡的DEAE－Sepharose Fast Flow层析柱，用0.01M pH7.0～7.5的PBS洗柱，再用含0.05M NaCl的0.01M pH7.0～7.5的PBS洗脱，收集0.05M NaCl溶液的第二个洗脱峰；

5）、将上述收集洗脱液适当浓缩后用无离子水透析或经Sephdex-G25柱去除NaCl。

5.如权利要求4所述的方法，其中，步骤1）蛇毒预处理的方法是将蛇毒适量预冷的0.01M pH7.0～7.5的PBS溶解，50％硫酸铵沉淀，取上清再经70％硫酸铵沉淀，取沉淀，用无离子水透析除盐。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，其中步骤1）蛇毒预处理的方法是：称取蛇毒若干克，用蛇毒重量5~10倍体积预冷的0.01M pH7.0～7.5的PBS于4~8℃的层析柜中搅拌溶解30~60分钟，缓慢添加硫酸铵至50％饱和度，静置2－4小时，之后于4~8℃、5,000~10,000g离心10~30分钟，取离心上清液，再缓慢添加硫酸铵至70％饱和度，静置过夜，次日于4~8℃、5,000~10,000g离心10~30分钟，取离心沉淀加适量0.01M pH7.0～7.5的PBS悬浮溶解得溶解液，将溶解液倾入截留分子量为7,000D~10,000D的透析袋，在层析柜中4~8℃对0.01M pH7.0～7.5的PBS透析12~24小时，期间更换PBS溶液2~4次；或将溶解液用分子截留值为5,000~10,000D的超滤膜经反复多次加入PBS进行稀释超滤浓缩脱盐。

7.如权利要求4所述的方法，其中，步骤2）和步骤4）采用0.01M pH7.0～7.5的PBS预平衡DEAE－Sepharose Fast Flow层析柱，然后上样。

8.如权利要求4所述的方法，其还包括将步骤5）除盐后的溶液直接冷冻干燥，或加入保护剂冷冻干燥。

9.如权利要求4~8任一项所述的方法，其中，步骤3）和步骤5）采用分子截留值为5,000~10,000D超滤膜的超滤浓缩方式降低目的蛋白洗脱溶液体积，然后进行透析脱盐；或采用分子截留值为5,000~10,000D的超滤膜将洗脱液经反复稀释超滤脱盐并浓缩蛋白。