[发明专利]一种小鼠异基因骨髓移植后cGVHD模型的建立方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种小鼠异基因骨髓移植后cGVHD模型的建立方法。建立具有模拟临床异基因造血干细胞移植后慢性移植物抗宿主病特点的疾病模型，可为慢性移植物抗宿主病的发生机制和诊治方法提供研究平台。

背景技术

慢性移植物抗宿主病是异基因造血干细胞移植后的主要并发症和死亡原因，成为影响患者生活质量和长期生存的关键因素。进一步明确cGVHD发生机制，研究积极有效的治疗方法，降低或减轻其发生及病程，具有重要的实际意义。因此，cGVHD动物模型的建立，是转化医学研究的重要基础。目前大部分cGVHD动物模型建立在H-2抗原半相合或微小不合的小鼠间移植，主要表现为狼疮样（SLE-cGVHD），受累靶器官主要为皮肤、肾脏、肝脏和小肠；及硬皮样（Scl-cGVHD），受累靶器官主要为皮肤。肺部cGVHD的模型曾有个别报道，因需要在预处理过程中使用环磷酰胺，考虑到药物本身对肺部的损害作用，该模型还有待进一步优化。本研究使用H-2抗原半相合小鼠，供鼠、受鼠均来源于国内常用的小鼠品系，方法简便；并且本研究中供受鼠配对模式与国内外相似研究报道不同，输注脾细胞数量较少，成模时间及症状符合临床异基因造血干细胞移植后慢性移植物抗宿主病的发生发展特点，肺部及皮肤cGVHD的表现非常典型，肝脏亦有部分cGVHD的表现。本方法提供了研究cGVHD的新模型，为国内大多数研究中心能够开展cGVHD发病机制、药物试验、细胞免疫治疗等相关研究奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种小鼠异基因骨髓移植后cGVHD模型的建立方法，通过以下步骤实现：

（1）以C57BL/6雌鼠（H-2^b）与BALB/c雄鼠（H-2^d）杂交出的CB6F1（H-2^bxd）代雄性小鼠作为供鼠；

（2）以BALB/c（H-2^d）雌性小鼠作为受鼠；

（3）受鼠接受全身照射预处理后，将获自供鼠的骨髓细胞BMC悬液及脾细胞SpC悬液注射至受鼠。

优选地，所述供鼠及受鼠均采用8周龄小鼠。

具体地来说，所述步骤（3）中，供鼠骨髓细胞BMC悬液的制备如下：以颈椎脱臼法处死供鼠后，放入75%乙醇中浸泡3~5min，无菌剥离股骨和胫骨，用RPMI1640培养液冲洗骨髓腔，收集含有骨髓的冲洗液制成单细胞悬液，过滤后用红细胞裂解液破除红细胞，RPMI1640洗涤若干次，计数并用RPMI1640重悬细胞，调整至5×10^7/mL细胞浓度备用。

具体地来说，所述步骤（3）中，供鼠脾细胞SpC悬液的制备如下：以颈椎脱臼法处死供鼠后，放入75%乙醇中浸泡3~5min，无菌取出脾脏，去除脾脏周围系膜组织，移入平皿内用RPMI1640培养液洗涤若干次，碾磨，收集细胞冲洗液制成单细胞悬液，过滤后用红细胞裂解液破除红细胞，用RPMI1640洗涤若干次，计数并用RPMI1640重悬细胞，调整至2.5×10^7/mL细胞浓度备用。

具体地来说，所述步骤（3）中，移植当日受鼠接受直线加速器700cGy单次全身照射预处理，照射后立即补充饮水，休息4~6小时后经尾静脉注射终体积为0.4mL的骨髓细胞BMC悬液及脾细胞SpC悬液。

优选地，所述步骤（3）中，注射给受鼠的骨髓细胞BMC悬液的用量为1×10^7BMC，脾细胞SpC悬液的用量为5×10^6。

本发明通过应用H-2抗原半相合子代小鼠的骨髓及脾细胞，移植给致死剂量辐照后的父代但不同性别的小鼠，建立一种异基因骨髓移植后cGVHD模型。其具有如下特点：（1）该模型具有模拟临床上异基因造血干细胞移植后慢性移植物抗宿主病的特点；（2）建模型效率高，重复性好；（3）造模所需小鼠容易获得，过程简单易行；（4）肺部、皮肤、肝脏等多器官同时发生典型病理改变；（5）移植后的小鼠存活时间长，更接近人类cGVHD的病征表现，为在活体动物内进行防治人类cGVHD的研究提供新的实验平台。

附图说明

图1是cGVHD实验组小鼠的临床评分示意图（图例中每个时间点的评分以均数±标准差表示，n＝5）

图2是cGVHD实验组小鼠临床表现；

图3是空白对照组和cGVHD实验组小鼠移植后+135d染色体图；

图4是移植对照组和cGVHD实验组小鼠135d处死后分离的肺、皮肤和肝脏的病理活检HE染色图。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。本实验所用小鼠均购自广州市中山大学实验动物中心。