[发明专利]MiR-181a-5p在非小细胞肺癌中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。本发明涉及一种miRNA、一个靶基因及其应用。

本发明涉及到用solexa测序和软件预测miRNA的靶基因、双荧光素酶报告基因分析和western-blot技术验证miRNA的靶基因以及过表达miR-181a-5p后利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖的变化、软琼脂实验检测对细胞集落形成的影响、流式细胞仪技术检测对细胞凋亡的影响。

背景技术

    MicroRNA（简称miRNA）是非编码小RNA 家族的成员之一，长度为18~25个碱基，通过碱基互补原理能结合到靶基因mRNA 的3'-端非编码区（3'-UTR），抑制靶基因mRNA的翻译或诱导其降解从而改变靶基因的蛋白表达水平，并通过细胞内复杂的网络调控体系，对生物体的发育、分化、增殖、凋亡、免疫等生理活动进行精确调节。

肺癌是癌症死亡的头号杀手，5年生存率不到15 %，其中非小细胞肺癌（non small cell lung cancer, NSCLC）占所有肺癌病例的80 %以上。肺癌的发生伴随着miRNA丰度的变化，miRNA 的表达具有时空特异性。在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有差异。miRNA的表达异常会使细胞表型发生相应的变化，继而导致疾病的诱发和肿瘤的形成。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种miRNA，其具有抑制非小细胞肺癌增殖的功能。该miRNA通过solexa测序分析挑选出，为miR-181a-5p，其成熟序列为(5′-aacauucaacgcugucggugagu-3′)。经CCK-8以及细胞集落等实验分析确定。

    本发明的目的之二在于提供miR-181a-5p在促进癌细胞凋亡中的应用。

本发明的目的之三在于提供miR-181a-5p在A549细胞系中的靶基因是Kras。A549购自    中科院生化细胞所细胞库。

为达到上述目的，本发明采用如下技术手段：

第一步，通过solexa测序结果，利用qRT-PCR技术寻找出miR-181a-5p表达下调的非小细胞肺癌细胞系，并在此细胞系过表达miR-181a-5p，以检测其功能。

第二步，利用流式细胞仪技术和CCK-8技术，分别检测过表达miR-181a-5p后A549细胞的凋亡、增殖情况。

第三步，用软琼脂实验来研究过表达miR-181a-5p后细胞集落情况。

第四步，将Kras的mRNA的3′-UTR连接到pGL-3载体，其上具有与miR-181a-5p种子序列相互补的碱基。将miR-181a-5p与重组质粒共转染HEK-293T细胞，48 h后检测荧光信号。

第五步，western-blot检测在蛋白水平Kras被下调情况。

附图说明

图1 非小细胞肺癌细胞系中miR-181a-5p的相对表达量；

图2 过表达miR-181a-5p后抑制A549细胞的增殖；

图3 过表达miR-181a-5p后转染NC、miR-181a-5p以及Anti-miR-181a-5p后显微镜下的细胞集落形态；

图4为过表达miR-181a-5p转染后平板下的细胞集落形态；

图5为过表达miR-181a-5p后细胞集落数的计数图；

图6过表达miR-181a-5p后促进A549细胞的凋亡，其中A为转染NC；B为转染miR-181a-5p；

图7 为通过双荧光报告基因检测miR-181a-5p对Kras的抑制；

图8为western实验中转染miR-181a-5p后Kras的蛋白表达量；

图9为通过软件检测到的Kras的相对蛋白表达量。

具体实施方式

 以下结合具体实例进一步阐述本发明。在具体实验步骤中常规方法参照《分子克隆》（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.）及试剂盒相关步骤。

实施例一：根据solexa测序结果，确定miR-181a-5p在非小细胞肺癌细胞系中低表达

先对正常小鼠的肺组织和患有非小细胞肺癌的小鼠的肺组织进行取样，用TRIZOL法提取总RNA。利用TaKaRa公司的反转录试剂盒构建两种组织的cDNA文库，以oligo dT为引物进行反转录，通过变性反应和反转录2步获得后续实验的cDNA。