[发明专利]一种动员间充质干细胞的制剂及分离方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要涉及一种动员间充质干细胞的制剂及分离方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是具有强大的增殖能力和多向分化潜能的成体干细胞。由于在一定条件下可分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱、神经等组织，MSCs已成为组织工程与再生医学十分有潜力的种子细胞。MSCs临床应用前景广阔：治疗骨、关节、肌腱缺损与损伤；促进神经细胞、心肌细胞、肝细胞再生；支持造血，促进造血干细胞植入；预防及治疗造血干细胞移植后移植物抗宿主病（GVHD）；免疫调节治疗自身免疫紊乱性疾病等。

骨髓为MSCs最为丰富的来源，在目前的临床试验与应用中，从供者或自身抽取一定量骨髓、体外分离培养为获取MSCs的主要途径。此方法可行易掌握，但也存在一些缺点：细胞来源受限、培养步骤繁琐、扩增到所需细胞量需要时间较长、培养液添加物非人源化、污染问题、致瘤风险等。MSCs体内动员方法的建立可以避免体外培养后移植治疗的诸多缺点，为MSCs的临床应用开辟新途径。

动员（Mobilization）是指干细胞由原组织位点进入外周循环的过程。干细胞动员是十分有潜力的疾病治疗方法，如造血干细胞动员目前已广泛应用于临床。间充质干细胞动员指应用动员剂或采用动员措施促使骨髓中MSCs释放并迁移到外周血。有效的MSCs动员可以避免体外培养后输注治疗存在的细胞污染、培养时间过长容易错过最佳治疗时间窗等缺点。MSCs体内动员具有体外培养后移植无法比拟的低创和高效性，因此对MSCs体内动员方法的研究十分有意义。许多研究者也曾尝试采用粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员MSCs，但结果令人失望。目前尚缺乏有效而临床可行的MSCs动员剂。

在前期研究中，我们首创性地发现缺氧诱导因子1α（HIF-1α）是间充质干细胞动员中的关键因子（Stem Cells Dev. 2011 20(11):1961-71)。 我们建立了缺氧诱导大鼠MSCs动员的动物模型，通过检测缺氧诱导MSCs动员的动力学，我们发现短期缺氧即可动员大鼠MSCs，经过鉴定动员进入外周血MSCs的免疫表型及成骨、成脂、成软骨能力与骨髓来源MSCs基本相似。在进一步的机制研究中，我们证实了HIF-1α在缺氧诱导MSCs 动员中起枢纽作用，而HIF-1α下游通路基质细胞衍生因子-1α（SDF-1α）及其受体CXCR4参与MSCs动员。HIF-1 是一个包含有HIF-1α与HIF-1β两个亚基的异源二聚体。HIF-1β是许多转录因子所共有的亚基，在细胞内呈构成性表达。HIF-1α则为HIF-1 的调节亚基与活性亚基。HIF-1的生理活性主要取决于HIF-1α亚基的活性和表达。HIF-1α表达量增加的调节主要在蛋白翻译后水平，即通过增加蛋白的稳定性，抑制其降解来实现。细胞处于常氧状态时，在脯氨酰羟化酶（prolyl hydroxylase, PHD) 的作用下, HIF-1α分子中402 位和564 位的脯氨酸残基被羟化。被羟化的HIF-1α可与肿瘤抑制蛋白von Hippel Lindau (VHL) 结合，后者可被识别发生泛素化降解。在该降解途径中，PHD 是起关键作用的酶。PHD属于Fe²⁺、2-酮戊二酸依赖的双加氧酶超家族，是HIF-1α 降解反应的限速酶。PHD抑制剂可以稳定HIF-1α的表达。研究发现，铁螯合剂氯化钴（CoCl₂）可以抑制PHD的活性，而抑制HIF-1α的羟化，减少常氧状态下HIF-1α的降解，被称为“缺氧模拟剂”。

SDF-1/ CXCR4 轴在干细胞体内动员中起着重要的作用。基质细胞衍生因子（SDF-1）是由骨髓基质细胞产生的CXC型趋化因子，CXC族细胞因子受体4（CXCR4）是目前所知的SDF-1的唯一受体。研究证实，SDF-1在内皮细胞受转录因子HIF-1直接调控。AMD3100为SDF-1α/CXCR4轴的小分子拮抗剂，能够有效阻断SDF-1α与CXCR4的相互作用而对CXCR4没有激动作用。

虽然根据文献报道和我们前期研究结果可知HIF-1/SDF-1α-CXCR4轴在MSCs动员中起关键作用，但是目前尚缺少一种有效的MSCs动员制剂，仍缺乏可行的MSCs动员方法。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明人首次发现缺氧模拟剂氯化钴（CoCl₂）可以诱导大鼠MSCs动员至外周血，而CoCl₂联合CXCR4的抑制剂AMD3100可显著提高动员效率。本发明提供了一种动员间充质干细胞的制剂及分离方法。