[发明专利]一种用于CYP3A5SNP rs776746分型快速检测的试剂盒和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，具体的说，本发明涉及一种用于CYP3A5SNP(rs776746)分型快速检测的试剂盒和检测方法。 

背景技术

人体内代谢药物的主要酶是细胞色素P450超家族(Cytochrome P450，CYP)，其是一类主要存在于肝脏、肠道中的单加氧酶。CYP3A是细胞色素P450的亚家族，主要存在于肝脏和小肠，约占肝脏CYP总量的30％，为肝脏和体内含量最为丰富的代谢酶，在已知CYP450参与代谢的药物中，约有50％是CYP3A介导的。CYP3A5的表达呈多态性分布，其功能仅在10％~20％的白人、33％的东方人和55％的美国黑人中存在，对药物代谢及其个体差异有重要的影响。CYP3A5催化药物的代谢和胆固醇、类固醇及其他脂类的合成涉及到许多反应。以强效免疫抑制剂他克莫司为例，临床口服主要用于预防和治疗器官移植后的排异反应。但是因其治疗窗较窄，CYP3A5基因多态性影响CYP3A5酶的表达，导致个体差异大，使服用相同剂量的他克莫司血药浓度不同。研究表明，位于CYP3A5基因第3内含子的A6986G，可引起个体间CYP3A5表达差异，GG型的个体(CYP3A5*3/*3)是最常见的突变型，可导致CYP3A5蛋白质的剪接缺陷，从而失去蛋白功能。这种基因型的个体，因代谢酶的缺失，服用相同剂量的他克莫司时，血药浓度高于AA型(CYP3A5*1/*1)或AG型(CYP3A5*1/*3)。 

文献“中国肾移植患者中不同的CYP3A5*3基因型与西罗莫司血药浓 度的关系”（《中国医药工业杂志》2010,41,9）公开了一种四引物PCR方法，但是按照该方法无法进行重现。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于CYP3A5SNP(rs776746)分型快速检测的试剂盒。 

本发明的目的还在于提供一种用于CYP3A5SNP(rs776746)分型快速检测的检测方法。 

为了实现本发明的方法，本发明提供一种用于CYP3A5SNP(rs776746)分型快速检测的试剂盒，包括：盒盖、盒体、能够嵌入所述盒体的装有酶反应混合物的容器、能够嵌入所述盒体的装有引物混合物的容器、能够嵌入所述盒体的装有阳性对照的容器、和能够嵌入所述盒体的装有水的容器。 

如本文中使用的，术语“能够嵌入盒体”是指根据需要容器可以自由地插入盒体和从盒体中取出。 

优选地，所述装有引物混合物的容器中装有外围引物1、外围引物2、内引物1和内引物2，所述外围引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO:l所示，所述外围引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述内引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述内引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。 

在本发明中， 

SEQ ID NO:l的序列为： 

5’-CTTGCAGCATTTAGTCCTTGTG-3’ 

SEQ ID NO:2的序列为： 

5’-ACCCAGGAAGCCAGACTTTGAT-3’ 

SEQ ID NO:3的序列为： 

5’-TTTAAAGAGCTCTTTTGTCTTTGAG-3’ 

SEQ ID NO:4的序列为： 

5’-TGTGGTCCAAACAGGGAAGAGATCT-3’ 

优选地，所述外围引物和所述内引物的浓度比为1:5~1:7。更优选地，所述外围引物1和所述外围引物2的浓度均为0.714μM，所述内引物1和所述内引物2的浓度均为4.286μM。 

优选地，所述阳性对照为GG型(*3/*3)、AA型(*1/*1)、AG型（*1/*3）的模版DNA。 

在本发明中，所述阳性对照例如可以采用下列方式进行获得： 

选取经过测序验证的CYP3A5SNP(rs776746)分型为AA型(*1/*1)及GG型(*3/*3)的两个血液基因组DNA； 

以上述DNA为模版，使用外围引物进行PCR产物扩增； 

将上述两个PCR产物纯化后，分别连接到T-载体上，并转化大肠杆菌。 

利用菌落PCR选取阳性克隆，并保存阳性菌株； 

接种上述阳性菌株过夜培养，并进行质粒提取，得到分别连有AA型(*1/*1)及GG型(*3/*3)目的片段的质粒DNA。