[发明专利]农杆菌介导的侵染月季芽点转基因的方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导的侵染木本植物芽点转基因的方法，其特征在包括如下步骤：获得木本植物芽点转基因所需无菌茎段；将茎段接种至培养基A使其长出芽点；将芽点从茎段上切下，并将其划伤；制备用于木本植物芽点转基因的农杆菌侵染液B；真空条件下用侵染液B侵染受伤的芽点；然后将侵染过根癌农杆菌侵染液B的芽点及根癌农杆菌共培养；将共培过的芽点接种在筛选培养基C上进行筛选培养；经过筛选后的生根苗移栽至温室中；对原位转基因月季植株做分子检测。

2.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于所述的获得木本植物芽点转基因所需无菌茎段是指将木本植物的茎秆或枝条将叶子去除掉，先用自来水冲洗10~30分钟，用剪刀将其建成2~5cm的茎段，接着用75%的乙醇溶液浸泡30秒进行表面消毒，用无菌水冲洗2~4次，再用2% (m/v) 的次氯酸钠浸泡8~10分钟，然后用无菌水冲洗4次以上后的茎段。

3.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于所述的将茎段接种至培养基使其长出芽点的培养基是指经过高温高压灭菌的MS固体培养基，其基本成分是MS+7g/L琼脂。

4.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于所述的将茎段接种至培养基使其长出芽点是指在无菌操作的条件下将无菌的茎段形态学的下端插入经过高温高压灭菌的固体MS培养基中，是茎段直立在培养基中，将其密封好，放在组培室中培养7天左右，待茎段上长出长度为0.5cm左右的幼芽。

5.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于所述的将芽点从茎段上切下，并将其划伤是指在无菌操作的条件下将长有幼芽的茎段从培养基中取出放在无菌滤纸上，用无菌的刀片将芽点从茎段上切下或剥落，然后用无菌刀片或无菌的7号针头将幼芽的生长点划伤或刺伤。

6.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于所述的制备用于木本植物芽点转基因的农杆菌侵染液B是指挑取携带有质粒pCambia2300的根癌农杆菌EHA105单菌落接种于50ml含100mg/L卡那霉素的LB培养基中，水浴摇床28摄氏度、150转/分钟，12~16小时，培养至根癌农杆菌菌液OD₆₀₀=0.6~0.8时，取出后在离心机上以4000转/分钟的转速离心10分钟后将上清倒掉，然后加入与上清液等体积的MS液体培养基后将农杆菌充分悬浮后所得的悬浊液。

7.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于所述的真空条件下用浸染液B浸染受伤的芽点是指将用无菌刀片划伤或用无菌针头刺伤的木本植物的幼芽浸泡在浸染液B中，保持无菌的情况下放入真空泵，打开真空泵处理30分钟左右。

8.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于所述的将浸染过根癌农杆菌浸染液B的芽点及根癌农杆菌共培养是指在无菌条件下将浸染过幼芽先用无菌的MS液体培养基冲洗一次，放在无菌滤纸上晾干后接种在含有MS固体培养基上在28摄氏度、黑暗条件下培养3~7天。

9.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于所述的将共培过的芽点接种在筛选培养基C上是指将经过共培养的芽点在无菌条件下从MS固体培养基上转移至含有100mg/L的硫酸卡那霉素的MS固体培养基上，每隔20天做更换一次培养基。

10.一种农杆菌介导的侵染月季芽点转基因的方法，其特征在于它包括的步骤：

1）获得月季芽点转基因的所需的无菌茎段：将月季的茎段的叶子先剪掉，然后通过自来水冲洗后剪成2~5cm的茎段，并进行75%酒精表面消毒、2%次氯酸钠灭菌后备用；

2）将茎段接种至固体MS培养基上使其长出芽点：在无菌操作的条件下将1）中所得无菌茎段形态学的下端插入经过高温高压灭菌的固体MS培养基中，使茎段直立在培养基中，将其密封好，放在组培室中培养7天左右，待茎段上长出长度为0.5cm左右的幼芽；

3）将芽点从茎段上切下，并将其划伤：在无菌操作的条件下将长有幼芽的茎段从培养基中取出，用无菌的刀片将芽点从茎段上切下或剥落，然后用无菌刀片或无菌的7号针头将幼芽的生长点划伤或刺伤；

4）制备用于月季芽点转基因的农杆菌侵染液

5）真空条件下用浸染液浸染受伤的芽点：将用无菌刀片划伤或用无菌针头刺伤的月季的幼芽浸泡在浸染液中，保持无菌的情况下放入真空泵，打开真空泵处理30分钟左右；

6）将浸染过根癌农杆菌浸染液的芽点和根癌农杆菌共培养3~7天；

7）对芽点转基因月季植株进行抗生素筛选

8）移栽经筛选后仍能存活的转基因植株

9）对经月季芽点转基因方法所得月季植株做分子检测

对经月季芽点转基因方法所得月季植株进行基因组PCR检测，Atchyb基因PCR引物为：

上引5^’ -3^’ tcaaccgccg ttacattc

下引5^’-3^’ cgagaccatc gtggacaa  

并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析抗性植株的转基因成功与否。