[发明专利]OB-FOLD作为支架用于工程化新的特异性结合物

权利要求书

1.OB-fold蛋白质的变体，其中所述OB-fold蛋白质被指定为起始OB-fold蛋白质，其中所述变体在与所述起始OB-fold蛋白质的天然配体的结合面包括5到32个突变的残基，其中所述变体结合感兴趣的靶，所述感兴趣的靶与不携带突变的起始OB-fold蛋白质的靶不同，并且其中亲和力最多在几百纳摩尔范围。

2.权利要求1的OB-fold蛋白质的变体，其中所述亲和力在皮摩尔范围。

3.权利要求1或2的OB-fold蛋白质的变体，其在与所述起始OB-fold蛋白质的天然配体的结合面包括8到20个突变的残基。

4.权利要求1-3任一项的OB-fold蛋白质的变体，其在与所述起始OB-fold蛋白质的天然配体的结合面包括11到16个突变的残基。

5.权利要求1-4任一项的OB-fold蛋白质的变体，其中所述起始OB-fold蛋白质的1到4个残基被缺失。

6.权利要求1-5任一项的OB-fold蛋白质的变体，其中所述变体在所述起始OB-fold蛋白质的环1、环3或环4的至少一个中包含1到15个氨基酸的插入。

7.获得权利要求1-6任一项的OB-fold蛋白质的变体的方法，其中所述OB-fold蛋白质的变体结合感兴趣的靶，所述感兴趣的靶与起始OB-fold蛋白质的靶不同，所述方法包括如下步骤：

a.提供所述起始OB-fold蛋白质的变体的组合文库，其中在所述起始OB-fold蛋白质和其天然配体的结合中所涉及的5到32个残基被随机化，并且任选其中所述变体还包含环3中的1到15个随机氨基酸残基的插入和/或环4中的1到15个随机氨基酸残基的插入、和/或环1中的1到20个随机氨基酸残基的插入，以及任选其中所述起始OB-fold蛋白质的1到4个残基被缺失;

b.通过核糖体展示表达所述文库的所述变体;

c.将步骤b获得的所述表达的变体暴露于固定的所述感兴趣的靶;

d.选择结合所述固定的感兴趣的靶的所述变体;

e.从步骤d选择的所述变体洗脱和回收mRNA;

f.对所述回收的mRNA进行反翻译和扩增，以获得所选择的所述起始OB-fold蛋白质的变体的亚文库;

g.再进行0-3轮所述步骤b至f;

h.通过核糖体展示表达步骤g之后所获得的所述亚文库的所述变体;

i.将步骤h获得的所述表达的变体暴露于经生物素化的所述感兴趣的靶;

j.对包含步骤i的所述表达的变体和所述感兴趣的靶的此组合物进行保温;

k.用磁性的链霉抗生物素包被的珠捕获与生物素化的感兴趣的靶结合的三元复合物(mRNA-核糖体-结合物);

l.洗涤所述珠并分离mRNA;

m.对所述回收的mRNA进行反翻译和扩增，以获得所选择的所述起始OB-fold蛋白质的变体的亚文库;

n.选择步骤m的所述亚文库的一个元件，其中所述元件编码所述起始OB-fold蛋白质的变体，其中所述变体在与所述起始OB-fold蛋白质的天然配体的结合面包括5到32个突变的残基，并且所述变体结合所述感兴趣的靶，其中所述变体对所述感兴趣的靶的亲和力最多在几百纳摩尔范围。

8.权利要求7的方法，其中在4℃进行所述步骤b、c、h和j。

9.权利要求7或8的方法，其中步骤j的保温进行至少2小时。