[发明专利]一种尿激酶原基因突变体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种尿激酶原基因突变体及其制备方法。 

背景技术

 尿激酶原（pro-UK,单链尿激酶性纤溶酶原激活剂，scu-PA）是一种单链丝氨酸蛋白酶原，成熟蛋白分子由411个氨基酸残基组成，分子量54KD。尿激酶原在纤溶酶、胰蛋白酶和激肽释放酶等作用下，在158位赖氨酸和159位亮氨酸（Ile）之间发生断裂，断裂之后形成的A和B两条肽链，两条链通过第148位与第279位的半胱氨酸（Cys148-Cys279）之间形成的二硫键相互连在一起，形成高分子尿激酶（HMW-UK）。高分子尿激酶的分子量与尿激酶原相同。高分子尿激酶能在纤溶酶作用下进一步发生水解，在Lys135-Lys136之间产生断裂，失去前面的135个氨基酸，形成低分子量尿激酶（LMW-UK）。尿激酶原、高分子量尿激酶和低分子量尿激酶均能激活纤维蛋白溶解酶原（plasminogen）, 使之成为纤维蛋白溶解酶（plasmin）。纤维蛋白溶解酶可以将血栓处的纤维蛋白和和其它血浆蛋白降解。因此，尿激酶原、高分子尿激酶和低分子尿激酶均能用于血栓治疗。但是，作为溶解血栓的药物，以尿激酶原最为安全，因为它在到达栓塞部位之前是没有活性的，到达治疗部位之后在原位发生降解，才生成能够激活纤维蛋白溶解酶原活性的尿激酶。由于这个缘故，使用尿激酶原作为溶栓药物时，可以通过一次性注射达到溶解血栓的用药剂量，治疗效果比较好；而尿激酶本身具有生物活性，能对给药通路上的血管壁产生影响，使用时必须控制给药速度，通过分步用药，逐渐达到治疗剂量。因此，当阻断血管的栓塞较大时，尿激酶的治疗效果不如尿激酶原好。 

尿激酶原是一种糖蛋白，蛋白质分子在体内合成之后需要进一步加工，在某些氨基酸残基（糖基化位点）上增加糖链。但是，作为溶栓药物，糖基化对尿激酶并不重要，在尿激酶原分子上增加糖链，既不能大幅提高它的生物活性，也不能有效降低它的分子在血液中被清除的速度。基于上述原因，工业化生产尿激酶原蛋白质，既可以采用真核细胞大规模培养技术，也可以采用基因工程细菌大规模发酵工艺。 

尿激酶原是一种真核生物蛋白质，其编码基因使用的遗传密码与原核生物有所不同，存在许多对于大肠杆菌来说是稀有的密码子。由于大肠杆菌中对应于这些稀有密码子的转移RNA丰度很低，蛋白质合成过程受到某些氨基酸供应的限制，故天然尿激酶原基因在基因重组大肠杆菌中的表达水平很低。若想采用微生物发酵技术大规模生产尿激酶原，必须采用的关键技术之一，就是优化基因中氨基酸的遗传密码，用大肠杆菌偏爱的密码子替换动物基因惯用的密码子。 

本发明分析了公开发表的人尿激酶原基因序列，发现若要在大肠杆菌中有效表达该基因，基因序列中有多达20个遗传密码需要替换。这些密码子在基因序列中的位置分散，难以用基因定点突变等简单操作将基因序列完全优化。 

发明内容

本发明的目的在于提供了一种尿激酶原基因突变体及其制备方法，它是适宜在大肠杆菌中表达的新型尿激酶原基因，实现了通过大肠杆菌发酵技术生产尿激酶原。 

本发明是这样来实现的，一种尿激酶原基因突变体，其特征在于在保持蛋白质的氨基酸组成和序列不变的前提下，在基因序列的5’端增加了两个核苷酸G和T，在序列的3’端增加了核酸内切酶Sal1的识别序列GTCGAC，其基因突变体的核苷酸序列为序列表1；突变基因序列包含一系列密码子替换；密码子代换的详细资料如下：第34位亮氨酸的密码子从CTA变为CTT，第64位异亮氨酸的密码子从ATA变为ATC，第79位精氨酸的密码子从CGA变为CGT，第107位组氨酸的密码子从CAC被更换成CAT，第108位精氨酸的密码子从AGA变为CGC，第123位精氨酸的密码子从AGG变为CGC，第128、129、130位连续三个精氨酸的密码子从CGG CGA AGG变换为CGC CGT CGC，第198位和199位两个精氨酸的密码子从AGG AGG 变为CGC CGT,第201位精氨酸的密码子从CGG 变换成CGC，第243位精氨酸的密码子从AGG变为CGT，第273位组氨酸的密码子从CAC变为CAT，第287位精氨酸密码由AGG变为CGC，第293位精氨酸密码子从AGG变为CGT，第295位异亮氨酸的密码子从ATA更换为ATT，第343位精氨酸的密码子从CGG变为CGC，第411位精氨酸的密码子从AGA变换成CGC。