[发明专利]一种植物病毒接种方法

说明书

技术领域

本发明属于植物保护和基因工程领域，提供了一种新的植物病毒接种方法，具体地说是一种利用农杆菌在田间大规模接种病毒的方法。 

背景技术

通过基因工程手段，可以构建植物病毒的侵染性cDNA克隆。利用侵染性cDNA克隆，可以研究明确病毒的致病机理，进而可以把该克隆改造成弱毒疫苗，通过交叉保护来保护植株免受强毒株系的侵染；也可以把病毒的侵染性克隆改造为表达载体，用来生产动物疫苗、抗病毒蛋白等高附加值的外源蛋白。目前，研制开发的弱毒株系和表达载体已经越来越多。 

限制弱毒株系和表达载体应用的瓶颈是大规模接种技术。根据侵染性克隆的不同特点，室内试验可以通过摩擦接种，基因枪接种或者是农杆菌浸润等方法接种试验植物。基因枪接种需要有专门的仪器，操作比较复杂，有的还需要抽真空，每批次能接种的植株数量很少。摩擦接种和农杆菌浸润不需要复杂的仪器，但每人每天接种的植株数量也有限。因此，这些方法只适合在实验室内应用，不适合在田间大规模地接种试验植物。 

在实际应用中急需开发适合植物病毒弱毒株系和表达载体大规模接种的方法。 

发明内容

针对现有接种方法无法满足田间大规模接种应用的需要这一问题，本发明提供了一种利用农杆菌在田间大规模接种病毒的方法，其包括如下步骤：将病毒的侵染性克隆转化农杆菌，经过培养后离心收集菌体，适当稀释后，将菌体喷布到叶片表面；农杆菌可以通过气孔和伤口侵染植物，从而将病毒带入植物细胞。本方法操作简单、成本低、效率高，适合在田间大规模接种病毒。本方法操作简单、成本低、效率高，适合在田间大规模接种病毒，可用来接种病毒的弱毒株系，以保护植株免受强毒株系的侵染，也可以利用病毒在植物体内表达抗病毒蛋白或生产疫苗。 

之所以采用这种方式，发明人主要是利用了农杆菌在自然界可以通过自然孔口（如气孔）和伤口侵入植物这一现象。本发明利用农杆菌的这一特点，将病毒基因组连接到合适的穿梭载体中，转化农杆菌，农杆菌通过气孔和伤口侵染植物，从而把病毒基因组带到植物细胞中中，使病毒在植物细胞内增殖。农杆菌可以用叶片喷雾的方式，解决了大规模接种病毒的技术问题，克服了限制弱毒疫苗使用的瓶颈问题。 

本发明实施的具体技术方案是： 

一种接种植物病毒的方法，其特征在于：将待接种病毒的侵染性克隆转化农杆菌，农杆菌培养后离心收集菌体，将其稀释到OD600为0.5-1.0，通过叶面喷施农杆菌接种植物病毒。喷雾时要兼顾到叶片的正反两面，喷雾器的喷嘴距叶片10－30厘米。 

其中所述的病毒可以是能够在农杆菌内繁殖的侵染性克隆。 

综上所述，本发明提供了一种全新的植物病毒接种方法。本方法操作简单、成本低、效率高，不需要特殊的仪器设备，利用普通的喷雾器就可以完成，适合在田间大规模接种病毒，可用来接种病毒的弱毒株系，以保护植株免受强毒株系的侵染，也可以利用病毒在植物体内表达抗病毒蛋白或生产疫苗，使用简单方便，成本低效率高，适合在科研温室、育苗公司的育苗棚或大田应用。 

附图说明

图1为采用本发明喷雾接种烟草脉带花叶病毒8天后烟草的感染情况， 

图中普通烟叶片出现病毒的侵染点，且病毒已经移动到叶脉； 

图2利用本方法接种病毒载体表达外源蛋白后的结果示意图， 

图中喷雾接种10天后，外源蛋白GFP在本氏烟中得到大量表达，植株上部叶片在紫外灯下表现出强烈的绿色荧光（右）。左图显示喷雾接种的病毒通过叶脉近、叶柄移动到其它部位； 

图3用本方法接种的弱毒株系对强毒株系的交叉保护效果示意图， 

图中A为先用喷雾法接种弱毒株系然后再接接种强毒株系的植株， 

B为直接接种强毒株系的植株， 

图中可见先用喷雾法接种弱毒株系的植株几乎看不到症状，而直接接种强毒株系的植株产生严重的花叶症状； 

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。 

实施例1：通过农杆菌喷雾表达外源蛋白(以GFP为例) 

1.病毒侵染性克隆转化农杆菌，采取液氮冻融法。