[发明专利]检测牛无浆体的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测动物血液病原菌的试剂盒，确切讲本发明涉及一种用于检测牛无浆体的试剂盒。

背景技术

无浆体（anaplasma）是一类经蜱传播的专性细胞内寄生菌，主要寄生于牛羊等反刍动物的血细胞中，其引起的疾病被称为无浆体病。1910年在北非首次发现了牛无浆体病，后来发现该病广泛分布于世界各地。无浆体病引起动物体重下降，流产，产奶量下降，严重者导致死亡，造成严重的经济损失。鉴于此，世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须通报的疫病。引起牛无浆体病的病原已证实的有边缘无浆体（anaplasma marginale）、中央无浆体（anaplasma centrale）、牛无浆体（anaplasma bovis）和嗜吞噬细胞无浆体（anaplasma phagocytophilum）。

牛无浆体(Anaplasma bovis)是无浆体属（Anaplasma）的一个重要成员，牛无浆体有广泛的宿主，已经证明它能寄生于牛、羊等反刍动物的体内，牛无浆体经节肢动物-蜱传播后寄生于宿主动物的血液的单核细胞内。牛无浆体在世界各地广泛流行，以前我国的牛无浆体病病原中并没有牛无浆体感染的报道，但在最近我们的调查中发现在我国许多地区存在牛无浆体，并且在某些地区呈高阳性率状态，应该引起高度重视，但目前针对该病原的检测方法仅有血涂片染色法和套式PCR方法。血涂片染色法在感染率很低或在感染早期时很难在显微镜下检查出病原，而且操作熟练程度将直接影响诊断结果的准确性。套式PCR检测方法,参见：Kawahara M, et al. 2006，Novel genetic variants of Anaplasma phagocytophilum,Anaplasma bovis, Anaplasma centrale, and a novel Ehrlichia sp.in wild deer and ticks on two major islands in Japan，Appl. Environ. Microbiol，2006. 72：1102-1109，但套式PCR检测过程中容易造成环境污染，而且费时费力。因此，建立一种快速、灵敏、准确又操作方便的检测方法十分必要。

发明内容

本发明提供一种可克服现有技术不足的用于检测牛无浆体的试剂盒。

本发明的检测牛无浆体的试剂盒内至少有如下的三条引物探针序列：正向引物SEQ№1，反向引物SEQ№2和探针SEQ№3，其中的探针序列的5端结合有荧光发光基团FAM，3端结合有连接MGB的非荧光淬灭基团。

为方便使用，在本发明的检测牛无浆体的试剂盒中还包括有如下成分：荧光定量PCR反应液、标准阳性质粒模板pGEM-Teasy-16S rRNA、阴性质控标准品。其中的荧光定量PCR反应液是由Premix Ex Taq^TM（2×）12.5μL ，正向引引物SEQ№1和反向引物SEQ№2（10μΜ）各0.5μL，荧光探针溶液（5μM）1.0μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.5μL，灭菌蒸馏水8.0μL组成。另外，本发明检测牛无浆体的试剂盒中的标准阳性质粒模板pGEM-Teasy-16S rRNA为由正向引物EE1和反向引物EE2扩增的DNA片段构建的pGEM-Teasy重组质粒；而阴性质控标准品可以是灭菌蒸馏水。

本发明实际上是一种利用16S rRNA基因检测牛无浆体的实时荧光定量PCR方法。实时荧光定量PCR( real- time fluorescent quantitative polymerasechain reaction， real-time FQ-PCR)技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR技术相比它所具有的特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、速度快、全封闭反应等优点，使其很快成为科研、临床诊断的热点技术。目前，国内外均未有检测牛无浆体实时荧光定量PCR方法的报道，本发明利用牛无浆体16S rRNA基因作为实时荧光定量PCR检测靶基因，设计针对牛无浆体16S rRNA基因的特异性引物和探针，从而提供了一种快速、灵敏、准确又操作方便的检测牛无浆体的方法，填补了技术空白。本发明中，通过对实时荧光定量PCR反应条条件的优化，使本发明具有良好的敏感性、特异性、重复性，其敏感性比套式PCR高10倍，可以用于牛无浆体的快速定量检测。

附图说明    

图1 为本发明的实时荧光定量PCR标准曲线。