[发明专利]傅立叶变换红外光谱技术对13种致病菌的分类鉴定

权利要求书

1.一种蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、阪崎肠杆菌、宋内氏志贺氏菌、单核细胞增生李斯特菌、弗劳地柠檬酸杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌及肠炎沙门氏菌等13种致病菌的分类鉴定方法，其特征在于数据库的建立：

对蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)ATCC12826、大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)ATCC43895、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC12600、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)ATCC12228、大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC10536、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)ATCC51329、宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei)ATCC25931、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)ATCC19114、弗劳地柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)ATCC10787、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)ATCC14028、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)ATCC49701、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)ATCC13047、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)CICC21482等13种标准菌株4000～600cm^-1波数范围的红外光谱依次进行如下处理：透过率-吸光度转化、基线校正、二阶导数(平滑点数17点)、矢量归一化、导数谱-excel数据转换，即建立了13种致病菌的红外光谱信息数据库。

2.根据权利要求1所述的13种致病菌的傅立叶变换红外光谱鉴别方法，其特征是依次包括以下步骤：

(1)细菌的培养：

用无菌接种环挑取细菌选择培养基上可疑B.cereus、E.coli O157:H7、S.aureus、S.epidermidis、E.coli、E.sakazakii、S.sonnei、L.monocytogenes、C.freunddi、S.typhimurium、E.aerogenes、E.cloacae、S.enteritidis一环，接种于盛有15mL营养肉汤的大试管中，36℃±1℃静置培养18-24h。

(2)硒化锌(ZnSe)窗片的制作：

吸取肉汤培养物1mL于1.5mL离心管中，5000g离心5min，吸弃上清，加入1mL无菌生理盐水悬浮洗涤，5000g离心5min，再加入1mL超纯水悬浮洗涤，5000g离心5min，超纯水重复洗涤两次。最后用50μL超纯水悬浮混匀。用微量移液器吸取菌悬液10μL于ZnSe窗片中心位置，水平置于45℃干燥箱中烘干至无水分的干燥菌斑。

(3)读取细菌4000～600cm^-1波数范围的红外光谱：

将载有样品的ZnSe窗片置于傅立叶变换红外光谱仪上进行光谱采集，光谱参数为：模式为透过率模式(采用气氛补偿功能去除环境大气中的水蒸气和CO₂的吸收光谱干扰)。实验参数为：波段范围4000～600cm^-1，光谱分辨率4cm^-1，64次光谱累计求平均。

(4)光谱预处理：

根据权利要求1，对光谱进行处理，得到由光谱转换的excel数据。

(5)对数据进行分级聚类分析(hierarchical cluster analysis，HCA)：

对上述处理的菌977.9-1895.3cm^-1波数范围光谱数据进行HCA；

HCA：皮尔森积矩相关系数(Ward’s method，Pearsonr)；

B.cereus、E.coli O157:H7、S.aureus、S.epidermidis、E.coli、E.sakazakii、S.sonnei、L.monocytogenes、C.freunddi、S.typhimurium、E.aerogenes、E.cloacae、S.enteritidis分别聚类到数据库中对应的B.cereus、E.coli O157:H7、S.aureus、S.epidermidis、E.coli、E.sakazakii、S.sonnei、Lmonocytogenes、C.freunddi、S.typhimurium、E.aerogenes、E.cloacae、S.enteritidis聚类群中。