[发明专利]一种高产三萜类化合物的樟芝菌丝体发酵方法

说明书

技术领域

本发明涉及发酵工程领域，尤其涉及高产三萜类化合物的樟芝菌丝体发酵方法。

背景技术

樟芝属担子菌纲，多孔菌目，多孔菌科，薄孔菌属，是一种珍稀的药用真菌，樟芝中含有多种生理活性成分，如多糖、三萜类化合物、超氧歧化酶（SOD）腺苷、蛋白质（含免疫蛋白）、多种维生素、微量元素、核酸、凝集素、氨基酸、胆固醇、木质素、血压稳定物质等。其具备的生理活性功能具有抗肿瘤、增强免疫力、抗病毒、抗过敏、抗高血压、抑制血小板凝集、降血压、降胆固醇、抗细菌、保护肝脏等。其中三萜类化合物是药用真菌的核心药理成分，具有强烈的生理活性，三萜类化合物是药用真菌发挥抗炎、镇痛、毒杀肿瘤细胞及诱发肿瘤细胞凋亡、抗缺氧等作用的主要成分；而且还具有提高机体免疫力的作用，表现在促进淋巴细胞增生，提高巨噬细胞、NK细胞、T细胞的吞噬能力和杀伤力。并能够有效促进肝细胞再生、修复和提升肝脏机能，有效地减少化疗期间病人肝脏和肾脏的损伤。

樟芝具有灵芝所有优点，功效更胜于灵芝，其有效成分三萜类化合物含量甚至是灵芝的十倍以上，因此素有“灵芝之王”的美誉。研究数据表明，单一品种的灵芝只有20‐50种三萜类化合物，不同品种灵芝的三萜类化合物总和才达到200多种，而单一品种的樟芝即有200多种三萜类化合物，而且无脂肪酸等杂质，抗癌效果更加出众。

樟芝人工培育可以分为三种方法，1）液体发酵法，2）固体栽培法，3）椴木栽培法。深层液体发酵是目前深度开发药用菌活性成分的最有效方法，可以快速、高效的获得樟芝菌丝体，并已在香菇、灰树花、巴西蘑菇、虫草拟青霉上实现规模化生产。

国内外已有文献报道樟芝液体发酵工艺，但研究主要集中在提高生物量和多糖，以提高樟芝三萜类化合物为目的的研究较少。台湾部分研究者研究了樟芝液体培养工艺，但是三萜类化合物产率较低。江南大学真菌研究实验室对樟芝液体发酵进行了研究，主要是以提高樟芝菌丝体产量为目标，樟芝三萜类化合物产量在65mg/L左右。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高产三萜类化合物的樟芝菌丝体发酵方法，不仅仅提高菌丝体的产量，更重要的是提高菌丝体中三萜类化合物的含量。

为达到上述目的，本发明的技术方案为，

一种高产三萜类化合物的樟芝菌丝体发酵方法，包括以下步骤，

斜面菌种活化，将樟芝斜面菌种转接至平板培养基上，待樟芝菌落直径大于2cm时，再次转接至新鲜平板培养基上培养，使菌丝体长满平板并形成橘红色孢子；

摇瓶液体种子制备，无菌收集樟芝孢子，接入摇瓶进行液体培养，待液体培养基出现浑浊而未形成菌丝球时停止培养，得到摇瓶种子；

液体种子扩培，将摇瓶种子转入种子罐进行菌种扩培，待发酵液出现浑浊而未形成菌丝球时，转入下一级种子罐，逐级扩大制备发酵生产用液体种子；

三萜条件发酵，将上述液体种子按10%接种量转入下一级发酵罐，进行三萜条件发酵，发酵条件为：25-30℃，pH值3.0-5.0，通气比0.3-2.0vvm，培养时间2-3天，三萜条件发酵培养基的成分为：玉米淀粉10-60g/L，麸皮10-60g/L，硫酸镁0.5-2.0g/L，橄榄油2-10ml/L。

所述三萜发酵条件为：28℃，pH值3.0，通气比0.35vvm，培养时间2天，三萜条件发酵培养基的成分为：玉米淀粉20-25g/L，麸皮20-25g/L，硫酸镁1.5-2.0g/L，橄榄油2-5ml/L。

所述液体种子扩培步骤中，种子罐接种量为10%，种子罐培养条件为：温度25-30℃，pH值3.0-5.0，通气比0.5-2.0vvm，培养时间3-5天；种子罐培养基组成：葡萄糖10-20g/L，麦芽浸膏10-20g/L，蛋白胨1-5g/L，硫酸镁0.1-1.0g/L。

所述种子罐培养条件为：温度28℃，pH值4.0，通气比1.0vvm，培养时间3天；种子罐培养基组成：葡萄糖18.8g/L，麦芽浸膏18.8g/L，蛋白胨3.3g/L，硫酸镁0.5g/L。

所述摇瓶液体种子制备步骤中，摇瓶液体培养的条件为：温度25-30℃，pH值5.0-7.0，转速100-150rpm，培养时间3-7天；液体种子培养基的成分为：葡萄糖10-20g/L，麦芽浸膏10-20g/L，蛋白胨1-5g/L，硫酸镁0.1-1.0g/L。

所述摇瓶液体培养的条件为：温度28℃，pH值4.0，转速120rpm，培养时间5天；液体种子培养基的成分为：葡萄糖18.8g/L，麦芽浸膏18.8g/L，蛋白胨3.3g/L，硫酸镁0.5g/L。