[发明专利]从临床标本中检测结核菌感染的逆转录PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及从临床标本中检测结核菌感染的逆转录PCR方法。

背景技术

现有技术中，常用的结核菌感染检测方法包括CSF抗酸杆菌涂片法和结核分枝杆菌培养检测法。CSF抗酸杆菌涂片法存在的不足之处在于阳性率低，约10％，且需要检材中的细菌≥10⁴/ml才能找到，特异性差。结核分枝杆菌培养检测法存在的不足之处在于操作复杂，培养时间较长，需4～8周，且阳性率低，多在20～30％。

发明内容

本发明的发明目的在于提供一种从临床标本中检测结核菌感染的逆转录PCR方法，操作简单，耗时短，阳性率高。

实现本发明目的的技术方案：

一种从临床标本中检测结核菌感染的逆转录PCR方法，其特征在于：用PCR检测方法对临床标本中结核菌的小RNA进行检测。

步骤一：提取临床标本中的总RNA；

步骤二：以步骤一中提取的总RNA为模板逆转录合成cDNA；

步骤三：针对结核菌小RNA检测引物和步骤二中合成的cDNA进行PCR检测。

优选地，步骤三中PCR反应体系包括2倍浓缩PCR反应缓冲液、dNTP、结核菌小RNA检测引物、步骤二中合成的cDNA模板和DNA聚合酶。

优选地，步骤三中PCR反应条件为，98℃10秒，68℃30秒，重复45个循环；PCR结果经过琼脂糖凝胶电泳和溴乙锭染色后，在紫外灯下显色拍照，有阳性条带的标本为结核感染患者。

优选地，步骤三中PCR反应体系为：2倍浓缩PCR反应缓冲液25微升、dNTP0.4mM、结核菌小RNA检测引物1微升、步骤二中合成的cDNA模板1微升、DNA聚合酶1.25单位，加去离子水补充体积至50微升。

结核菌小RNA检测引物可以为以下各组引物其中的一组：

第一组：正向引物SEQ ID NO.1：5′-TCGTCGTCGACGCTTAGGTA-3′

        反向引物SEQ ID NO.2：5′-TGGGTTGGACGACTCGACGT-3′

第二组：正向引物SEQ ID NO.3：5′-ATCGGTGCCGGACCAGTTCA-3′

        反向引物SEQ ID NO.4：5′-AGCTGGTACTTCGCACCGGA-3′

第三组：正向引物SEQ ID NO.5：5′-CGGCCTGCGTATGACCCATA-3′

        反向引物SEQ ID NO.6：5′-AGGCGTTGTTGGCCACTTAT-3′

第四组：正向引物SEQ ID NO.7：5′-CGGATAGCCCCGTGTTGTTG-3′

        反向引物SEQ ID NO.8：5′-CTGGGTCCCCTCCCACCAGC-3′

第五组：正向引物SEQ ID NO.9：5′-ATAGAGGACGGAGTCGGTGA-3′

        反向引物SEQ ID NO.10：5′-AGAAACTTCGCCTCGAGGTA-3′

第六组：正向引物SEQ ID NO.11：5′-CCACGTACTCGATCCCGTTG-3′

        反向引物SEQ ID NO.12：5′-ACTTGGGGGGATTGGGAGGT-3′

第七组：正向引物SEQ ID NO.13：5′-AACTCCCCCAGGGCTGGAAG-3′

        反向引物SEQ ID NO.14：5′-CGTGGGTATACCGAGGTCCA-3′

第八组：正向引物SEQ ID NO.15：5′-CTCGGCCATAGCCGAGGGTG-3′

        反向引物SEQ ID NO.16：5′-AGGGACGACCCCCGCCAGGG-3′

第九组：正向引物SEQ ID NO.17：5′-CGGGACTCCTGAGAAGGATC-3′

        反向引物SEQ ID NO.18：5′-CGCACGTCAGCCCCACCCGT-3′

本发明具有的有益效果：