[发明专利]促进奶牛乳腺上皮细胞体外分化的培养基及其应用

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种促进奶牛乳腺上皮细胞体外分化的培养基及其应用。

背景技术

随着生物学技术的发展，体外培养的奶牛乳腺上皮细胞可作为一种较理想的模型用来研究乳蛋白基因表达，但是在体外利用乳腺上皮细胞作为模型研究氨基酸对乳蛋白合成的影响时遇到了问题，目前研究者在培养奶牛乳腺上皮细胞时大都使用DMEM/F12培养基，在使用DMEM/F12培养基条件下在奶牛乳腺上皮细胞CSN1S1、CSN3基因表达量较低，说明此种培养基促进奶牛乳腺上皮细胞体外分化培养的效果不明显。本发明依据Invitrogen公司所公布的DMEM/F12配方对培养基进行了改进，进而达到在体外促进奶牛乳腺上皮细胞分化的目的。

发明内容

本发明的目的是针对上述存在问题，提供一种氨基酸含量优化后促进奶牛乳腺上皮细胞体外分化的培养基及其应用。

本发明的技术方案：

本发明一方面涉及一种促进奶牛乳腺上皮细胞体外分化的培养基，所述培养基的配方如下：

在本发明的一个优选实施方式中，所述的培养基的pH值介于7.0-7.4之间。

在本发明的另一个优选实施方式中，所述的培养基中包括或者不包括除水以外的其它组分。

本发明另一方面还涉及上述培养基在制备乳腺上皮细胞时上调该细胞CSN1S1和/或CSN3基因表达中的制剂中的应用。

本发明的培养基与商品化DMEM/F12培养基相比乳腺上皮细胞CSN1S1、CSN3基因表达显著上调(P＜0.05)，上调量分别达到了3.57倍和3.27倍，此外，本发明的培养基在奶牛乳腺上皮细胞增殖、泌乳相关基因表达和酪蛋白合成方面无负面影响。

附图说明

图1酶消化法所获得的不同时期细胞的形态；

图2培养的奶牛乳腺上皮细胞角蛋白免疫组化鉴定(×400)；

图3MTT法检测的两种培养基的细胞活性；

图4奶牛乳腺上皮细胞增殖培养基对乳腺上皮细胞CSN1S1、CSN3基因表达量的影响；

具体实施方式

1.1主要试剂

胎牛血清(Gibco10099-141)、0.25％Trypsin-EDTA(Gibco25200-056)、DMSO(Sigma D2650)、双抗(Gibco15140-122)、胰岛素转铁蛋白(Gibco51500-056)、胶原酶II(Gibco17101-015)、EGF(Gibco PHG-0313)、DPBS(Hyclone SH30028-01B)、MTT(AMRES10)、催乳素(Sigma L6520)、氢化可的松(Sigma H0135)、L-谷氨酰胺(Sigma G-8540)、角蛋白18小鼠单克隆抗体、山羊抗小鼠IgG-FITC(上海生工)、SYBR Premix Ex Taq T M II(TaKaRa DRR081)、细胞总RNA提取试剂盒(TIANGEN DP430)。

1.2原代乳腺上皮细胞的培养

选取泌乳中期的健康中国荷斯坦奶牛，采集乳腺深层组织适量(注意避开结缔组织和脂肪组织)，放入加有双抗的DMEM/F12培养基中，放入保温盒中迅速带回实验室。在超净台中用含有3倍双抗的DPBS溶液冲洗乳腺组织块3遍，再放入75％的乙醇溶液中浸泡30s，再用含有1倍双抗的DPBS溶液冲洗至清澈。在培养皿中使用眼科剪刀和镊子精细选取腺泡组织，放入5ml细胞冻存管中，再次使用眼科剪刀将其剪碎，放入等体积0.05％II型胶原酶溶液，放置于37℃、5％CO₂培养箱消化90min，期间每隔20min震荡一次。取出已消化完成的溶液，使用80目网筛过滤，将滤液移入15ml离心管中，1500r/min离心3min，弃去上清液，加入培养基后重新悬浮，接种于25cm²细胞培养瓶中，放入37℃、5％CO₂培养箱内培养。

1.3乳腺上皮细胞鉴定

将纯化好的乳腺上皮细胞以2×10⁴个/mL接种到35mm培养皿中，待细胞长成半汇合单层时进行免疫荧光染色，使用倒置荧光显微镜进行观察。

1.4奶牛乳腺上皮细胞促分化培养基的配制

奶牛乳腺上皮细胞促分化培养基成分及含量见表1。

表1奶牛乳腺上皮细胞促分化培养基成分及含量