[发明专利]一种重组人多功能生长因子Pleiotrophin融合蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及重组融合蛋白的表达，特别涉及一种重组人多功能生长因子Pleiotrophin融合蛋白及其制备方法。

背景技术

多功能生长因子（pleiotrophin）是1989年由华盛顿大学医学中心纯化得到的一种生长因子，当时认为该因子为17kDa的蛋白，与肝素具有高度亲和性，并首次被命名为HBGF-8(heparin．binding growth factor-8）。Ptn基因位于7q33-q34，长度大于100kb，编码168个氨基酸，蛋白大小15.3kD，在SDS聚丙烯酰胺电泳表现为18kD。PTN正常表达于胚胎期，在成年的健康组织中很少表达，在大脑中表达水平最高，除此之外，还可表达于子宫、睾丸Leydig细胞等。PTN主要作用有：(1)对肿瘤的发生、生长与转移、肿瘤血管生成有重要作用；(2)在中枢神经系统内对轴突生长、突触生成、神经肌连接等有重要作用；(3)其他如促进有丝分裂、促进骨发育等作用；(4)促进造血干细胞扩增和及再生。因此pleiotrophin可作为营养支持多巴胺能神经元药物，同时缓解帕金森病的症状，为帕金森病的治疗提供一个新思路。

鉴于Pleiotrophin重要的生物学功能，获得高纯度有活性的Pleiotrophin蛋白，可作为营养支持多巴胺能神经元的基因药物，具有应用于帕金森病治疗的前景。而由于Pleiotrophin基因的mRNA二级结构复杂，不利于真核系统的外源表达；且单独表达Pleiotrophin蛋白，由于表达量较小的原因，也会影响后期基因药物的效率。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种重组人多功能生长因子Pleiotrophin融合蛋白及其制备方法，对Pleiotrophin基因进行了表达和纯化，并验证了该融合蛋白对神经经典细胞模型PC12细胞具有促进生长的活性。

本发明是通过以下技术解决方案来实现：

一种重组人多功能生长因子Pleiotrophin融合蛋白，在人多功能生长因子Pleiotrophin结构域的N端还依次连接有纯化标记序列、凝血酶和肠激酶酶切位点，以及Nus序列。

所述的人多功能生长因子Pleiotrophin的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

所述的纯化标记序列为6×His的标记序列。

所述的重组人多功能生长因子Pleiotrophin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

一种表达重组人多功能生长因子Pleiotrophin融合蛋白的原核表达载体，该原核表达载体为pET44a₍₊₎-pleiotrophin，是通过EcoR I/XHo I酶切位点将如SEQ.ID.NO.3所示的人多功能生长因子Pleiotrophin基因片段，克隆入pET44a₍₊₎表达载体。

一种重组人多功能生长因子Pleiotrophin融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1）以包含完整人Pleiotrophin基因编码框的cDNA为模板，以引物对P作为引物，PCR扩增人pleiotrophin基因片段，所述的引物对P为：

上游引物P1：aggaattcatgcaggctcaacagtacc；

下游引物P2：agctcgagtaaatccagcatcttctcc；

2）将PCR扩增的人pleiotrophin基因片段用EcoR I/XHo I双酶切得到双粘性末端的片段；并将该片段与EcoR I/XHo I双酶切的pET44a₍₊₎载体连接得到表达载体pET44a₍₊₎-pleiotrophin；

3）将表达载体pET44a₍₊₎-pleiotrophin转染到感受态的大肠杆菌，筛选得到目的基因表达的阳性转化子；