[发明专利]一种等温扩增核酸片段的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种等温扩增核酸片段的方法，特别是用与靶序列三个区域互补的一对引物通过链替代反应扩增核酸片段，该方法可作为特异基因片段的快速扩增检测手段。

背景技术

随着现代分子生物学和分子技术的发展，研究开发了许多核酸扩增技术。其中核酸环介导等温扩增技术（专利ZL 00818262.0，ZL01810370.7，ZL01812204.3，ZL02815992.6，ZL200610080379.7），由于其具有特异性强、灵敏度高、反应速度快的特点，在核酸特异性扩增和检测领域具有取代PCR的趋势，成为生命科学领域研究的热点之一。核酸环介导等温扩增的主要原理是基于对靶序列的6个区域设计2对特异引物，利用一种链置换 DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase），在65℃左右的等温条件下保温约60分钟，即可完成核酸扩增反应，存在环引物的情况下，扩增时间可进一步缩短为40分钟，同时具备不需要热循环、扩增效率更高、不需要特殊仪器等优点。

然而环介导等温扩增技术需要针对核酸片段的6-8个区域设计引物，其中至少核酸片段的6个区域（F3_C、F2_C、F1、B1、B2_C和B3_C）与2对引物（实质是3对引物：F3，F1_C-F2、B1_C-B2、B3）完全匹配才能进行扩增，如果加上环引物（LF、LB），需要设计4对引物，引物二聚体的产生很难避免，引物二聚体引起的假阳性问题也很难避免，限制了该技术的推广应用。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种采用一对引物等温扩增核酸片段的方法，该方法可作为特异基因片段的快速扩增检测手段。

上述目的是通过如下技术方案实现的：

一对引物，其特征在于，针对核酸片段，采用PrimerPremier5.0等引物设计软件，设计两对类似于巢式PCR的又不具有重叠序列的引物F1、F2、R2、R1，其中，F2的互补序列F2_C连在F1的5’端；或R2的互补序列R2_C连在R1的5’端。

引物组合，根据上述引物设计方法，四种引物组合方式分别为F2_C-F1、R1；F1、R2_C-R1；F2_C-F1、R2；F2、R2_C-R1，任何一种组合方式都可以实现核酸片段的等温扩增。