[发明专利]一种荧光定量检测羟基自由基的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种荧光定量检测羟基自由基的方法，特别是涉及一种以苯五甲酸为荧光探针的荧光定量检测羟基自由基的方法。

背景技术

活性氧是指比分子状态氧（空气中存在的氧）反应性更活泼的、含有氧原子的分子或自由基，如羟基自由基(HO^·)、超氧阴离子自由基(O₂^-·)、单线态氧(¹O₂)及过羟基自由基(HOO^·)等。活性氧的测试涉及各个领域，包括纺织化学、造纸制浆、医学、食品、环境中。在上述含氧类自由基中,羟基自由基是水溶液中最强的氧化剂之一，可引发诱导产生链反应,主要通过电子转移、亲电加成、脱氢反应等途径无选择性地与各种有机化合物直接作用并最终将其降解为CO₂、H₂O等无害物质。

目前检测羟基自由基的方法主要包括分光光度法、电子自旋法(ESR)、化学发光法、电化学法、高效液相色谱法(HPLC)等(Zhou KQ,et al.,Food Chem.2006,95:446-457;Christopher J.,et al.,Anal.Chem.2011,83:261-268;Kilinc E.,et al.,Talanta,2005,65:876-881;Chao T,et al.,Anal.Chim.Acta2004,527:73–80;吴峰等，专利CN1412553A,2003-4-23)，但以上检测大部分在标准体系中进行，且都有不可避免的缺陷，难以实现快速准确检测。分光光度法仪器易为一般实验室采用，但测定的准确性较差，灵敏度较低，专一性不强；ESR仪器成本较高，灵敏度低，专一性不强；化学发光法经常产生人工活性氧干扰结果；电化学检测则有电极面积及定位的限制，抗干扰能力不强，选择性差，应用范围有限；高效液相色谱法(HPLC)操作复杂耗时，且固定相的存在会引起自由基的各种反应而使自由基猝灭。荧光分析法(Peter W.,et al.,Free Radical Bio.Med.,2007,43:995-1022)具有简单快速、灵敏度高、易于实现自动化、可视化和在线检测等特点，而且仪器廉价，在一般实验室中较常见，因此近年来在羟基自由基检测中备受关注。

荧光分析法检测羟基自由基的体系一般都需选用捕获剂，利用捕获剂与羟基自由基反应后底物荧光强度的改变，实现间接测定活性氧的浓度。目前采用的捕获剂有水杨基荧光酮(任凤莲等，分析化学，2001,29(1):60-62)和罗丹明6G(Jing F,et al.,J.Fluoresc.,2007,17:257–264)等荧光染料，利用羟基自由基的强氧化作用可使染料体系降解，荧光强度减弱，实现Fenton体系中羟基自由基的荧光检测。但此类荧光减弱型检测方法的选择性和重现性较差，不适合于复杂体系如纺织品前处理高温氧漂工艺体系中羟基自由基的检测。二甲基亚砜也为一种羟基自由基捕获剂，有人采用分光光度法(潘光建，中国造纸学报，2006,21(3):41-47)和荧光光度法(谷学新，分析科学学报，2002,18(6):460-462)研究了二甲基亚砜(DMSO)捕捉羟自由基的反应，但反应步骤较长，定量检测不准确。

另一类荧光增强型的常用捕获剂为苯甲酸和对苯二甲酸，这类捕捉剂普遍被认为可与羟基自由基反应生成稳定的2-羟基苯甲酸，通过检测羟基化产物的荧光可间接检测羟基自由基的产生情况。苯甲酸首先被用于羟基自由基的荧光检测，Vidrio等人利用苯甲酸荧光检测环境中颗粒物导致的羟基自由基产生量(Vidrio,E.,et al.,Environ.Sci.Technol.,2009,43,922-927)。检测原理是苯甲酸本身没有荧光，但在捕捉羟基自由基发生加成反应后，生成荧光性产物邻羟基苯甲酸，通过检测荧光强度，可间接测定羟基自由基。从分子结构上可以看出，苯甲酸分子中苯环上有5个反应位点，因此羟基自由基的加成反应没有选择性，但只有加成在邻位的羟基化衍生物才会产生荧光。由于苯甲酸分子的不对称结构，苯甲酸与羟基自由基加成反应也可得到不发荧光的间位和对位羟基化衍生物，也就是说发生了对荧光没有贡献的无效加成，这使得通过荧光强度测定并不能准确检测羟基自由基，捕捉效率低。