[发明专利]一种抑制肿瘤细胞侵袭的shRNA

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种新型shRNA的构建及应用。具 体而言，本发明针对人肿瘤细胞表面分子CD14基因的核苷酸序列设计合成 shRNA，所述shRNA转入胃癌细胞后能抑制所述肿瘤细胞的迁移。

背景技术

RNA干扰是机体内广泛存在的一种双链RNA介导的序列特异性基因沉默 现象[Fire A，Xu SQ，Montgomery MK，et al.Potent and specific genetic interference  by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature1998；391：806-811]，因其 具有沉默效率高、特异性强以及操作简便等优于传统基因敲除手段的优点而得 到迅速发展，现成为生命科学领域中重要的研究工具[Arziman Z，Horn T，Boutros  M.E-RNAi：a web application to design optimized RNAi constructs.Nucleic Acids  Res2005；33：W582-W588]。

shRNA即小发卡RNA或者短发卡RNA(a small hairpin RNA or short hairpin  RNA，shRNA)，是一段外源性的具有茎环结构的RNA序列，能够在细胞内加工 成siRNA，siRNA进而与蛋白质结合形成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced  silencing complex，RISC)。该复合物能够结合到同源的mRNA上并诱导其降解。 shRNA的作用具有严格的靶向性，特异性靶位点的选择具有位置效应，不同的 靶位点对同一基因的干扰效率有着很大的差异[Reynolds A，Leake D，Boese Q，et  al.Rational siRNA design for RNA interference.Nat Biotechnol 2004；22：326-330]。

CD14虽然为LPS的高亲和受体，但没有跨膜区域，需要在TLR4的配合下 将信号传导入核并激活NF-kB[Gioannini TL，Weiss JP.Regulation of interactions  of Gram-negative bacterial endotoxins with mammalian cells.Immunol Res 2007； 39：249-260]，也有学者认为CD14是接收LPS刺激并引发核因子转录激活的主 要信号分子，能够介导细胞的凋亡并调节细胞周期[Zanoni I，Ostuni R，Capuano G， et al.CD14 regulates the dendritic cell life cycle after LPS exposure through NFAT  activation 2009；460：264-8]。CD14基因启动子区多态性与胃癌、大肠癌、前列腺 癌[Dan Zhao，Tong Sun，Xuemei Zhang.Role of CD14 Promoter Polymorphisms in  Helicobacter pytori Infection Related Gastric Carcinoma.Clin Cancer Res  2007；13(8)：2362-2368]等易感性的关系已有诸多报道，其与细胞增殖及凋亡的直 接联系也逐渐引起人们的注意。Kevyn等[Kevyn L，Comstock，Kevin A，et al. LPS-Induced TNF-a Release from and Apoptosis in Rat Cardiomyocytes：Obligatory  Role for CD14 in Mediating the LPS Response.J Mol Cell Cardiol  1998；30：2761-2775]认为CD14能够响应LPS信号，诱导TNF-α的释放进一步促 使心肌细胞凋亡。CD14中和抗体能够延迟BLP引发的中性粒细胞凋亡，同时 加入TLR2中和抗体后其抑制凋亡的作用加强。Waldemar等[Waldemar  Kanczkowski，Piotr Tymoszuk，et al.Abrogation of TLR4 and CD14 Expression and  Signaling in Human Adrenocortical Tumors.J Clin EndocrinolMetab  2010；95(12)：421-429]发现CD14 mRNA在肾上腺皮质癌组织、腺瘤以及肾上腺 皮质癌细胞株中表达显著降低甚至缺失，在CD14和TLR4共转染的肾上腺皮质 癌细胞株中检测到NF-kB的激活，同时细胞活性受到抑制，凋亡细胞数目增加， 表明CD14可能介由NF-kB途径参与了癌细胞增殖与凋亡的调控。