[发明专利]一种亲和兼容性链霉亲和素突变体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程、蛋白质工程和发酵工程领域，涉及一种DNA分子的合成、突变、重组和载体构建技术，尤其涉及一种亲和兼容性链霉亲和素突变体及其制备方法。 

背景技术

链霉亲和素（Streptavidin，SA）是由阿维丁链霉菌（Streptomyces avidinii）培养过程中分泌的一种小分子非糖基化蛋白质，全长编码区183个氨基酸（aa），包含24aa的信号肽（见序列表中SEQ ID No: 1），成熟分子159aa (见序列表中SEQ ID No: 2)。菌体外的天然活性形式为从13～139aa的成熟肽(见序列表中SEQ ID No: 3)，分子量15kD，其天然形式为同源四聚体，分子量60kD，SA的成熟活性结构为127个氨基酸的多肽，称为SA核心序列，具有抗蛋白酶的特性。1963年，Dr. Stapley首先发现并报道。 

本世纪以来，SA由于其与生物素（Biotin，又称维生素H、辅酶R）有极高的亲和力和特异性而受到国际生物学和医学界的高度重视。SA对其配体生物素的亲和力（10^-16 M/L）比已知的抗原-抗体的亲和力（10^-7～10^-12 M/L）高4～6个数量级。高亲和力和高特异性并不是SA的唯一特性，SA与Biotin的结合速度极快，即便是在极低浓度和4℃环境下也是如此。另外，由于生物素是小分子，因而蛋白生物素化几乎不影响生物功能。SA-Biotin复合物可以耐受变性剂（如6M盐酸胍）、去垢剂（如SDS）、90℃高温和3～11pH环境。与其他靶向标签（如Halo-Tag和SNAP-Tag）相比，SA有更多便利，不论是体外或体内，其可借助大肠杆菌的生物素连接酶（E. coli biotin ligase）将其配体标记到目标蛋白。SA的这些特性，引发了科学家对SA和其配体Biotin进行各种生物改造的兴趣。 

野生型SA（wtSA）分子与Biotin的结合速度（on-rate）虽然很快，但结合力不够稳定持久（high off-rate），这对需要连续长时间观察的动态实验（如细胞生物学领域）与影像研究较为不利。另一方面，wtSA与生物素的异乎寻常的亲和力（10^-16mole/L），又使得分离制备时，需要变性条件下洗脱。尽管wtSA对生物素的亲和力极高，但其对某些极具用途的生物素衍生物，如2-亚氨基生物素，则结合力不够理想（兼容性不理想），这也提出了对SA进行分子改造的必要。 

尽管过去20年来，已经报道有200多种突变型SA（mtSA），但关于SA突变后提高结合稳定性的研究很少。2012年，Mark Howarth，Oxford （GB）公开了稳定性结合SA突变体研究（美国专利申请号: US 2012/0214970 A1），测试并保护了3个双位点突变体S52G/R53D，S52G/R53N，S52G/R53S （见序列表中SEQ ID No: 4，SEQ ID No: 5，SEQ ID No: 6），指出该类突变体的主体序列必须在第23、27、43、45、49、79、88、90、92、108、110、120、128与野生型SA相同。 

早在2000年，R. Charles Cantor（Boston University）对SA的亲和兼容性进行了研究，公开了2个SA的突变体（EP0977770 A1），它们是N23A、S27E或S27D（见序列表中SEQ ID No: 7，SEQ ID No: 8），该突变体对Biotin的亲和力降低了至少10个数量级，提高了对2-亚氨基生物素（2-iminobiotin）和 Diaminobiotin的亲和力，可用于分离2-亚氨基生物素化的蛋白。 

发明内容

鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种全人工基因合成的密码子优化和突变引入的亲和兼容性链霉亲和素突变体SA128m4及其制备方法，亲和兼容性链霉亲和素突变体SA128m4既有兼容性亲和力，又有低的解离速度（off-rate）。 

本发明的目的将通过以下技术方案得以实现： 

一种亲和兼容性链霉亲和素突变体，所述亲和兼容性链霉亲和素突变体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:9所示，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:10所示。

优选的，上述的一种亲和兼容性链霉亲和素突变体，其中：所述亲和兼容性链霉亲和素突变体包含4个氨基酸的突变，分别为Y22N、N23Y、S52G、R53D。