[发明专利]一种定点突变改造的基因工程腈水解酶

说明书

技术领域

 本发明属于基因工程领域，涉及一种定点突变方法制备具有改善的腈水解酶活性及降低的酰胺生成能力的基因工程真菌腈水解酶。其关键是真菌腈水解酶的定点改造、克隆、表达及产物的发酵表达及分离纯化制备，以及定点突变的基因工程菌在烟酸合成中的应用。

背景技术

自1964年哈佛大学学者Thimann等人首次在大麦叶中发现并分离到了一种植物蛋白，也就是所说的腈水解酶。它能有效地水解吲哚乙腈合成生长激素吲哚乙酸（Thimann等，Arch Biochem Biophys 1964, 105 (1):133-141）。至今为止已发现来源于细菌、丝状真菌、酵母及植物体中的腈水解酶产生机体上百种，他们能将苯甲腈、丙烯腈、乙腈、甘氨腈等腈类化合物转化为相应的有机酸及氨基酸，并且能应用于腈污染废水的生物除污以及纺织工业中聚合材料的表面修饰。其中一些高效的腈水解酶应用于工业规模的羧酸生产中也已经取得了良好效果，如广州龙沙的烟酸工业生产工艺及三菱化工的扁桃酸生产工艺都是非常成功的案例，这也充分体现了腈水解酶的应用潜力。相关的研究与开发使得腈水解酶在制药、食品、化工、环保等领域具有广阔的应用前景。

烟酸是维生素B3的前体，作为维生素类药物，可用于防治糙皮病等烟酸缺乏症；可用作血管扩张药，治疗高脂血症；也可用于治疗头痛、肺栓赛、冻伤等病症；作为医药中间体，烟酸可用于异烟肼、烟酰胺、烟酸肌醇酯等的生产；另外，烟酸的一个重要用途是可用做饲料添加剂。因此，目前市场需求量非常大。烟酸生产的传统工艺主要采用氨氧化法、气相氧化法及喹啶羟基化法等化学方法来进行生产（CN201210089804.4）。但是这些方法需要采用昂贵的催化剂进行反应，使用强酸碱使设备腐蚀严重，而且产率较低，使得产品的分离纯化难度加大，此外生产工艺过程对环境存在比较严重的污染（CN101550432）。

采用绿色环保的生物催化工艺进行烟酸生产在近年来受到了极大的关注。生物催化法反应条件温和、催化剂特异性高、选择性强、能耗少、催化剂制作成本低廉、工艺环境友好。这是化学生产工艺所无法比拟的。

自上世纪80年代后期以来，全球已有多家机构开展了腈水解酶催化法制备烟酸工艺的研究。至今已有来自不同单位的学者分别采用细菌归属的玫瑰红球菌Rhodococcus rhodochrous J1（Mathew等，Appl Environ Microbiol1988, 54 (4):1030-1032），苍白芽孢杆菌Bacillus pallidus （Almatawah等，Enzyme Microb Technol1999, 25 (8-9):718-724），小球诺卡氏菌Nocardia globerula（Sharma等，Process Biochem2006, 41 (9):2078-2081），以及红球菌Rhodococcus sp. NDB 1165（Prasad 等，World J Microbiol Biotechnol2007, 23 (3):345-353）产生的腈水解酶作为催化剂生物转化3-氰基吡啶制备得到烟酸。而进入21世纪以来，来自捷克的学者研究发现真菌腈水解酶在比酶活、选择性方面特征具有更明显的优势，表现出比细菌腈水解酶更大的催化潜力（Vejvoda等，Process Biochem 2010, 45 (7):1115-1120），他们以茄病镰刀菌Fusarium solani O1和黑曲霉菌Aspergillus niger K10为研究目标，将其应用于3-，4-氰基吡啶制备烟酸和异烟酸的生物转化中，取得了良好的效果（Martínková等，Biotechnol Adv 2009, 27 (6):661-670）。但是这两株菌所产生的真菌腈水解酶均存在微弱的腈水合酶活性，转化过程中在生成羧酸的同时会产生一定量的酰胺类化合物。而且研究表明这一副反应几乎存在于所有真菌腈水解酶的生物转化反应中。

定点突变技术近年来在酶的基因工程改造中应用日益广泛，在提高酶活性、改善酶的催化特征等方面取得了非常有益的效果。但是该技术在腈水解酶的改造中还应用较少，尤其对于真菌腈水解酶，鲜有定点突变改造的文献报道，而在国内，尚未见任何关于基因工程改造真菌腈水解酶的文献或专利报道。因此，定点突变改造真菌腈水解酶的研究具有极佳的理论和应用价值。

发明内容