[发明专利]携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的菌株、构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌工程菌株。 

背景技术

杆菌肽为淡黄色或类白色粉末，无嗅，味苦，是由10种氨基酸、12个氨基酸残基构成的多肽类抗生素，可有效抑制革兰氏阳性病原菌和部分革兰氏阴性菌。杆菌肽通过组氨酸的咪唑基和噻唑环，与多种金属离子如Cu²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Zn²⁺和Mn²⁺等生成络合物，其中以锌盐形式存在的杆菌肽，抑菌活性得到一定程度的增强，且稳定性最好。杆菌肽拥有在肠道内几乎不吸收，排泄迅速，体内不残留等优点，因此被广泛添加于饲料中。 

杆菌肽的作用机理是：一、其络合物能吸附在细菌的细胞壁上，阻碍脱磷酸化作用，影响磷脂的运转和向胞壁支架输送粘肽复合物，导致细胞壁合成受到抑制，细胞逐渐死亡；二、结合敏感菌细胞膜脂蛋白中的游离磷酸盐，导致细胞膜损伤，通透性增加，各种离子、氨基酸、嘧啶、嘌呤等外流；三、干扰敏感菌细胞内原浆蛋白的合成。 

目前，杆菌肽主要生产菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其通过微生物发酵法生产，微生物发酵过程中，氧气对好氧微生物的生长繁殖和进行能量物质代谢尤为重要，但微生物只能利用溶解在培养基中的氧，从而使氧气供应成为限制发酵产量的一大瓶颈。 

透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin,VHb)是在革兰氏阴性菌透明颤菌中发现的一种氧调节蛋白，透明颤菌在限氧条件下大量诱导合成该蛋白，使其在限氧条件下正常生长。VHb能特异性结合O₂，并且高速释放，从而促进微生物细胞内氧的传递，提高氧的利用率，这种特性使之能够充分利用有限空间中的氧气。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种能高产杆菌肽的携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的菌株、构建方法及应用。 

本发明的目的通过如下技术方案实现： 

一种携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌，其特征在于：所述菌株为地衣芽孢杆菌(pHY300-vgb)[Bacillus licheniformis(pHY300-vgb)]，该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2011345，保藏日期为2011年10月12日。 

一种携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的构建方法，其特征在于：质粒pDG1730-vgb⁺经BamH I和Hind III双酶切得到的1246bp vgb片段，该片段含有芽孢杆菌编码乙酰高丝氨酸内酯(AHL)自身诱导物(AI)合成酶luxS基因的启动子P_luxS和vgb ORF；质粒pHY300PLK经BamH I和Hind III双酶切得到4870bp线性质粒片段；1246bp vgb片段与4870bp线性质粒片段经DNA连接酶连接作用，得到表达载体pHY300-vgb；将表达载体pHY300-vgb转入大肠杆菌进行保存，其后通过电转化转入原始菌株——地衣芽孢杆菌(B.licheniformis DW2)，以四环素抗性为筛选标记，筛选得到地衣芽孢杆菌(pHY300-vgb)[Bacillus licheniformis(pHY300-vgb)]。 

一种携带透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌的应用，其特征在于：它在杆菌肽发酵中的应用。 

较之现有技术而言，本发明的优点在于：在地衣芽孢杆菌的表达载体pHY300PLK中连接上透明颤菌血红蛋白基因，构建了一种能在低氧环境下诱导表达透明颤菌血红蛋白，提高宿主菌在低氧发酵环境下的摄氧能力，改善细胞在低氧环境下的生理状态，从而改善了含此基因的宿主菌在发酵中的供氧问题。地衣芽孢杆菌(pHY300-vgb)[Bacillus licheniformis(pHY300-vgb)]单位菌体杆菌肽产量较原始菌株B.licheniformisDW2提高了9.4805%。 

附图说明

图1是血红蛋白基因重组载体构建方法示意图。 

图2为pHY300-vgb的阳性克隆的筛选鉴定图。 

图3是转化子质粒VHb基因的PCR鉴定图。 

图4是CO制备装置图。