[发明专利]甘油发酵法制备1,3-丙二醇

说明书

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，一种甘油发酵法制备1，3-丙二醇的方法。

背景技术

1，3-丙二醇是有广阔应用前景的化工原料，主要用做聚醋和聚氨酯的单体以及溶剂、抗冻剂或保护剂等。此外，1，3-丙二醇还可用作增塑剂、洗涤剂、防腐剂、乳化剂的合成，也可作为产品中的组分如化妆品、打印机墨水、清洁剂、稳定剂和燃料电池燃料等的添加剂来提高产品的性能。作为医药和有机合成的中间体，1，3-丙二醇可用于食品、化妆品和制药等行业。1，3-丙二醇作为中间体还生产多醇聚酯及作为碳链延伸剂，还可用于制备其它不饱和聚酯，如聚萘二甲酸丙二醇酯(PTN)和共聚聚酯以及制备新型聚氨酯树脂等。

1，3-丙二醇的生产方法有化学法和生物法，中国专利CN101134713A，CN1431183A等均是采用化学法，但是化学合成法副产物多，产品提纯分离困难，生产成本高。相比之下，生物转化法生产1，3-丙二醇以其利用再生资源、对环境污染小等特点越来越受到重视。

目前生物合成法生产1，3-丙二醇存在产物浓度低，生产周期长和甘油转化率低等问题，因此，采用廉价易得的原料，在温和条件下制备1，3-丙二醇，对于提升1，3-丙二醇和下游产物的制备以及扩大应用都有特别重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种合成由甘油发酵合成1，3-丙二醇的方法，实现1，3-丙二醇的条件温和、成本低廉制备。

本发明是这样实现的：将伊纽小单孢菌中sisI的3’，4’-双脱羟基酶基因通过基因重组和DNA重排等技术得到2’-脱羟基酶基因(sisII)。通过克隆得到sisII，随后将其构建到pET30a表达载体，并在E.coli BL21实现异源表达，构建甘油脱水合成1，3-丙二醇(PDO)的工程菌BL21-sis，同时采用超分子自组装模板法固定化，然后在含有甘油的培养基中发酵合成1，3-丙二醇，通过过滤发酵液、有机溶剂萃取等获得产品1，3-丙二醇。具体技术方案如下：

1)将伊纽小单孢菌中sisI的3’，4’-双脱羟基酶基因通过基因重组和DNA重排等技术得到2’-脱羟基酶基因(sisII)，通过PCR方法加上生物砖标准化酶切位点EcoRI，hindIII并与生物砖骨架Pet30a连接，进行同义突变，完成生物砖元件Pet-sis的构建；

2)将构建好的Pet-sis，转化到大肠杆菌BL21中，甘油保种；

3)进行发酵培养前先在种子培养基中培养，用无菌注射器将种子液第1次接种于装有种子培养基的血清瓶中再培养，将扩培的种子液第2次接种于装有发酵培养基的发酵罐中发酵后，得产物1，3-丙二醇。

在步骤1)中，PCR仪、凝胶成像仪和蛋白电泳仪购自美国BIO-RAD公司。

在步骤2)中，所述的伊纽小单孢菌购自买Takara公司，所述大肠杆菌BL21购买Takara公司。

在步骤3)中，所述种子培养基可采用LB培养基；所述培养的条件可为37℃、150r/min摇床培养；所述第1次接种的接种量可为5％；所述再培养的条件可为37℃、150r/min摇床培养；所述第2次接种的接种量可为10％；所述发酵的过程中可向发酵罐中通氮气来维持体系的厌氧条件，并控制pH为6.8；所述发酵的过程中可加入补料混合溶液，所述补料混合溶液由甘油组成；所述分析发酵液中甘油和1，3-丙二醇浓度的方法可采用美国安捷伦高效液相色谱Agilent1100分析发酵液中甘油和1，3-丙二醇浓度。

在步骤3)中，在发酵过程中，可每间隔1～3h取样，测定发酵液的菌体OD值，分析发酵液中甘油和1，3-丙二醇的浓度。

本发明的优点在于将伊纽小单孢菌中sisI的3’，4’-双脱羟基酶基因通过基因重组和DNA重排等技术得到2’-脱羟基酶基因(sisII)。通过克隆得到sisII，将其构建到pET30a表达载体，并在E.coli BL21实现异源表达，构建甘油脱水合成1，3-丙二醇的工程菌BL21-sis，同时采用超分子自组装模板法固定化，然后在含有甘油的培养基中发酵合成1，3-丙二醇。这种方法的益处在于大大突破了甘油生物法生产1，3-丙二醇甘油转化率低的瓶颈，提高了底物转化率，缩短了发酵时间，从而降低了生产成本，为微生物利用甘油发酵法生产1，3-丙二醇的工业化奠定了基础。

具体实施方式

通过以下实施例进一步详细说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施例的限制。

实施例1

1)生物砖元件Pet-sis的构建