[发明专利]一种从抗虫棉种子中纯化Bt毒蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体涉及一种从抗虫棉种子中纯化Bt毒蛋白的方法。

背景技术

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）在形成芽孢的过程中会产生一种伴胞晶体，该晶体的主要成分是具有杀虫活性的蛋白质，被称为杀虫晶体蛋白(ICP,Insecticidal Crystal Protein)，又称Bt毒蛋白。

Bt毒蛋白可毒杀鳞翅目、双翅目、鞘翅目等昆虫，是目前世界上应用最为广泛的生物杀虫剂。虽然人畜并非Bt毒蛋白的天然靶向物种，但围绕转Bt基因作物是否对人畜和环境有害的争论从未停止。

目前研究所使用的Bt毒蛋白绝大多数来自于原核表达，由于外源基因在植物体内的表达产物可能存在复杂的翻译后修饰过程，可能会导致蛋白质在性质和功能上发生变化，所以使用原核表达的Bt毒蛋白并不能完全真实地反映转Bt基因作物的危害。

Bt Cry1Ac蛋白为Bt毒蛋白中的一种，其氨基酸序列如序列表的序列1所示，基因序列如序列表的序列2所示。

发明内容

本发明的目的是提供一种从抗虫棉种子中纯化Bt毒蛋白的方法。

本发明提供的从抗虫棉种子中纯化Bt毒蛋白的方法，包括如下步骤：

（1）将抗虫棉种子去壳后进行可溶性总蛋白的提取，得到溶液甲；

（2）将所述溶液甲进行60%饱和度的硫酸铵沉淀，离心收集沉淀；

（3）溶解步骤（2）得到的沉淀并进行透析，得到溶液乙；

（4）将所述溶液乙进行免疫亲和层析，收集与抗Bt Cry1Ab/Ac蛋白的单克隆抗体特异结合的蛋白组分，即为Bt毒蛋白；所述抗Bt Cry1Ab/Ac蛋白的单克隆抗体为是由杂交瘤Bt2F9CGMCC No.5162分泌产生的单克隆抗体。

杂交瘤Bt2F9为稳定分泌抗转基因植物中Bt Cry1Ab/Ac蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞株，已于2011年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.5162。

所述步骤（1）中，可采用pH10.5、0.01M的CAPS缓冲液提取所述可溶性总蛋白。

所述步骤（1）中，所述溶液甲的制备方法具体如下：将所述抗虫棉种子去壳并研磨成粉，然后用pH10.5、0.01M的CAPS缓冲液提取（提取温度具体可为4℃，提取时间具体可为4小时；提取过程中可用磁力搅拌器搅拌，以增加提取效率），离心（离心条件具体可为：4℃、10000rpm离心20分钟）后避开表层油脂取上部液体，即为所述溶液甲。

步骤（1）中：Bt毒蛋白是碱溶性蛋白，使用碱性溶液进行可溶性总蛋白的提取能提高Bt毒蛋白的提取效率；可溶性总蛋白的提取过程中会使种子内部的蛋白水解酶释放到溶液中，在4℃下进行可溶性总蛋白的提取，可以使蛋白酶的活性降低，提高Bt毒蛋白的提取效率；可溶性总蛋白的提取过程中使用磁力搅拌，可以混匀提取体系，防止局部蛋白浓度过高而降低蛋白质进入溶液中的速率。

所述步骤（2）中，所述“进行60%饱和度的硫酸铵沉淀”的实现方法如下：在所述溶液甲中加入硫酸铵并使其达到60%饱和度，然后冰浴放置。所述冰浴放置的时间具体可为40分钟。所述冰浴放置过程中可用磁力搅拌器搅拌。所述离心的参数具体可为：4℃、7000rpm离心20分钟。

步骤（2）中：抗体对蛋白质抗原的识别依赖于蛋白质一定的空间构象，温度较高容易使蛋白质的空间构象发生改变，从而导致不能被抗体识别，在冰浴中进行硫酸铵沉淀可以避免Bt毒蛋白的构象发生改变，减少操作造成的Bt毒蛋白损失；硫酸铵沉淀的过程中使用磁力搅拌，可以混匀沉淀体系，使硫酸铵浓度迅速均匀化。

所述步骤（3）中，可用去离子水溶解所述沉淀并用Tris水溶液调pH至10.5。所述Tris水溶液具体可为1M Tris水溶液。所述透析具体在PBS缓冲液中进行。所述透析的条件具体可为：用PBS缓冲液4℃透析6小时（每两个小时更换新的PBS缓冲液）。

步骤（3）中：使用去离子水和1M Tris水溶液溶解沉淀，去离子水中含有极微量离子，能减少盐溶性杂蛋白的溶解，使用Tris是促使溶液迅速变为碱性，有利于Bt毒蛋白的溶解。