[发明专利]稳定转化家蚕细胞株滴定BmNPV法及报告基因构建法

权利要求书

1.报告基因转化载体的构建方法，其特征是包括如下步骤： 

1）、构建报告基因转移载体；

2）、PCR合成含多角体启动子及多聚腺苷酸加尾序列的报告基因表达盒；

以报告基因转移载体为模板，扩增上游为多角体启动子（Polyhedrin Promoter, P_polh）下游为多聚腺苷酸加尾序列（PolyA）的报告基因表达盒；

3）、获得报告基因转化载体：

通过双酶切转化载体pIZT/V5-His制备OpIE2启动子（OpIE2 promoter）和OpIE2多聚腺苷酸加尾序列（OpIE2 polyadenylation sequence）两个元件之外的转化载体；在T4 DNA连接酶的作用下，将步骤2）所得的报告基因表达盒PCR产物经同样双酶切后连接到所述转化载体中，筛选鉴定克隆有报告基因表达盒的重组转化载体。

2.根据权利要求1所述的报告基因转化载体的构建方法，其特征是： 

所述报告基因为红色荧光蛋白基因（DsRed）、β-半乳糖苷酶基因（LacZ）。

3.根据权利要求1或2所述的报告基因转化载体的构建方法，其特征是：

所述步骤1）为：

将报告基因的PCR产物用BamHI和EcoRI双酶切后，通过T4 DNA连接酶连接至同样经BamHI和EcoRI双酶切的pBacPAK8转移载体上，所得的重组质粒为报告基因转移载体。

4.报告基因稳定转化家蚕细胞的筛选方法，其特征是包括如下步骤：

1）、将作为报告基因转化载体的重组质粒转染家蚕BmN细胞；

2）、稳定转化细胞株的筛选：

按照培养基中博来霉素（Zeocin）终浓度为300μg/mL的条件进行培养筛选，符合稳定发出绿色荧光条件的为报告基因稳定转化的家蚕细胞，简称家蚕稳转细胞；最终筛选获得比例达99%的家蚕稳转细胞即为该报告基因的稳定转化细胞系。

5.利用报告基因稳定转化家蚕细胞株测定家蚕BmNPV病毒滴度的方法，其特征是包括如下步骤：

1）、细胞培养：

将家蚕稳转细胞进行培养；

2）、病毒样品的制备：

将待测BmNPV样品进行10 倍系列的梯度稀释；

3）、病毒接种：

在步骤1）所得的家蚕稳转细胞中加入步骤2）所得的梯度稀释后的病毒样品进行培养，每个稀释度设置若干个重复；

4）、统计细胞感染率：

根据步骤3）所得的病毒接种后家蚕稳转细胞被BmNPV感染的情况；统计每个稀释度的阳性孔数和阴性孔数；

5）、计算病毒滴度：

根据各稀释度的阳性孔数和阴性孔数，按Reed-Muench法计算该病毒的TCID₅₀值。