[发明专利]一种利用荧光探针检测DNA单核苷酸多态性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测DNA单核苷酸多态性的方法，特别涉及一种利用荧光探针检测DNA单核苷酸多态性的方法。

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。因此，通常所说的SNP都是二等位多态性的。

单核苷酸多态性是人类可遗传的变异中最常见的一种，有90%都可归因于SNP所引起的基因变异。在人基因组中，每隔100至300个碱基就会存在一处SNP。基因组DNA中单核苷酸多态性的分析和测定可用来绘制基因图谱、进行基因联合研究等。

单核苷酸多态性是第三代遗传诊断标记，近几年被广泛应用于生物以及医学研究的诸多领域，分析方法常采用电泳分析和固相杂交的方法，如：DNA测序、限制酶切片段长度多态性分析、单链DNA构象多态性分析、异源双链核酸分析、等位基因特异性寡聚核苷酸杂交、错配酶切分析、寡聚核苷酸连接分析等，但上述方法对样品处理的要求较高，需要进行繁琐的分离或洗涤的程序，增加了样品的损失以及检测的时间。为了避免上诉问题，目前常采用一种均相免疫检测的方法，该方法基于荧光偏振或小分子荧光染料之间的荧光共振能量转移，但偏振化荧光的强度大大降低，导致了基于荧光偏振的方法灵敏度不高，除此之外，基于荧光共振能量转移的方法均要对探针分子进行双修饰，导致成本很高。因此，设计出一种更为灵敏、有效的单核苷酸多态性检测方法是极为迫切的。

发明内容

本发明的目的是提供一种克服上述缺点，高效、灵敏、简便、快速、无需分离的利用荧光探针检测DNA单核苷酸多态性的方法。

实现本发明目的的技术方案是：一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法，依次包括以下步骤：

1）以待测样本的DNA为模板进行PCR扩增，并用荧光物质标记待测样本的DNA；

2）通过所述荧光物质与下述式（I）的化合物荧光共振能量转移情况确定所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸；所述荧光物质的吸收光谱与所述式（I）的化合物发射光谱有较好的重叠,光谱重叠积分范围为8.0×10^-16 ～ 5.0×10^-13 M^-1cm³。

式（I）；

式（I）中，R代表链端含有四级胺的直链或支链的烷基，所述烷基的主链长为2-12个碳，X代表卤素；所述式（I）化合物的数均分子量为5000-20000。

上述一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法的式（I）中，R为 6-三甲胺基己基、6-三乙胺基己基、5-三甲胺基戊基、5-三乙胺基戊基、4-三甲胺基丁基、 4-三乙胺基丁基、3-三甲胺基丙基和3-三乙胺基丙基中的任意一种。

上述一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法的式（I）中，X为氯、溴和碘中的任意一种。

上述一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法用荧光物质标记步骤1）的DNA的方法为：用荧光物质标记的dNTP或ddNTP对PCR扩增产物进行单碱基延伸；所述dNTP或ddNTP为与所述目标单核苷酸多态位点的核苷酸相邻的一个核苷酸互补的dNTP或ddNTP。

上述一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法的单碱基延伸中，所用的引物有两种：野生型特异性引物和突变型特异性引物；所述野生型特异性引物的末端核苷酸与所述目标单核苷酸多态位点的野生型核苷酸互补；所述突变型特异性引物的末端核苷酸与所述目标单核苷酸多态位点的突变型核苷酸互补；所述引物能与目标单核苷酸多态位点相邻20-25bp的序列互补。

上述一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法确定所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点核苷酸的方法为：若只在使用野生型特异性引物时出现荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为野生纯合型；若只在使用突变型特异性引物时出现荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为突变纯合型；若使用两种引物都出现荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为杂合型。