[发明专利]一种真菌病毒双链RNA快速提取试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于试剂盒制备技术领域，具体涉及一种从真菌中快速提取病毒双链RNA(double-strand RNA，dsRNA)的试剂盒及其应用方法。 

背景技术

单链RNA病毒在增殖过程中需要对自身的核酸进行复制，进而组装形成新的病毒粒子，完成对寄主的系统性侵染。双链RNA是病毒在这一复制过程中产生的一类特殊的RNA。其存在往往预示着病毒的侵染和复制。故而病毒双链RNA已经成为判断及鉴定未知单链RNA病毒的重要依据。此外，由于双链RNA直接含有病毒的基因组序列，故其对于病毒的分子生物学研究也具有重要意义。因此，双链RNA的提取在这一过程中显得尤为重要，其质量将直接影响后续实验结果。 

现有的双链RNA提取方法均基于纤维素粉在一定条件下对双链RNA的吸附作用(Bar-Joseph et al.，1983；Valverde et al.，1990；邱立友等，专利公开号：CN101086011)。其主要步骤为：使用含十二烷基硫酸钠(SDS)的缓冲溶液裂解细胞后，用中性酚对蛋白质等杂质进行抽提。向抽提后的细胞裂解液中加入无水乙醇至体积/体积比达到15％-18％时，使用纤维素粉制成的填充柱进行过滤吸附。最后对填充柱进行洗涤，并加入去离子水或TE(Tris-EDTA)缓冲溶液进行洗脱回收双链RNA。这类方法虽然已经证明对真菌及植物病毒双链RNA的提取具有较好效果，然而也存在以下问题：首先，由于纤维素粉对双链RNA的吸附效率并不高，为了得到足够的双链RNA用于后续实验，此类方法往往需要较多的生物材料用于双链RNA的提取。一些稀有的珍贵样品可能因为样品量不够而无法得到满足后续实验要求的足够的双链RNA。其次，此类方法的实验周期较长。由于真菌菌丝及一些植物样品中多糖含量较高，往往使得细胞裂解液较为粘稠。在过柱吸附时往往造成溶液无法顺利通过纤维素柱，而只能由其在重力作用下缓慢渗透通过。造成操作时间的延长并增加了双链RNA降解和污染的风险。此外，由于最后回收双链RNA需要较大体积的洗脱液，得到的双链RNA还需要进一步进行乙醇沉降浓缩，才能最终用于后续实验。进一步延长了实验时间，使得整个实验过程需要1-2天时间才能完成。再次，由于提取所要求的样品量较大，则整个实验操作无法在微量离心管中完成。限制了一次实验中所能处理的样品数量，不利于大量样品的高通量处理。近年来，一些研究者先后对植物及真菌病毒双链RNA的提取方法进行了改进。与上述方法相比，改进后的方法省略了用酚对细胞裂解液进行抽提的步骤，缩短了操作时间(Tzanetakis and Martin，2008；Balijja et al.，2008)。然 而，这些改进仍然没有从根本上解决传统方法操作步骤多、样品起始量大、处理样品数量有限的问题。此外，由于改进后的方法中并没有添加额外的步骤除去蛋白质等杂质，势必对双链RNA的质量造成不利影响。综上所述，一种操作步骤更为简单、更适合于在微量离心管中完成的高通量提取方法将为双链RNA的提取及病毒的分子生物学鉴定带来更大的便利。 

发明内容

本发明在于克服现有技术的缺陷，提供一种高通量的简单快捷的真菌病毒双链RNA提取试剂盒，本发明还涉及该试剂盒的应用。本发明的试剂盒具有操作步骤更为简单，更适合于在微量离心管中完成的高通量提取方法将为双链RNA的提取及病毒的分子生物学鉴定带来更大的便利，所获得双链RNA可用于相关的病毒分子生物学的后续研究中。 

实现本发明的技术方案如下所述。 

一种适用于真菌病毒双链RNA快速提取试剂盒，其包含以下试剂组合物： 

(1)细胞裂解液，由阴离子去污剂、无机盐、pH缓冲剂、螯合剂、抗氧化剂组成，具体是： 

a.按重量/体积计十二烷基硫酸钠(SDS)2％； 

b.按重量/体积计聚乙烯吡咯烷酮-40(PVP-40)4％； 

c.氯化钠0.5mol/L； 

d.三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(pH8.0)(Tris-HCl，pH8.0)50mmol/L； 

e.乙二胺四乙酸钠(pH8.0)(EDTA，pH8.0)25mmol/L； 

f.按体积/体积计巯基乙醇1％； 

(2)核酸吸附液，由离液盐、无机盐、pH缓冲剂组成，具体是： 

a.按重量/体积计异硫氰酸胍50％； 

b.氯化钾1.5mol/L； 

c.氯化铵0.5mol/L； 

d.乙酸钠(pH5.9)100mmol/L；