[发明专利]从鸡蛋清中提取卵巨球蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及卵巨球蛋白的提取方法，具体为一种从鸡蛋清中提取卵巨球蛋白的方法。

背景技术

鸡蛋清来源广泛，价格低廉，干物质中蛋白质含量超过80%，是最理想的蛋白质资源之一。卵巨球蛋白是鸡蛋清中一种具有重要生物活性的蛋白质，其含量仅为蛋清蛋白质的0.5%，因其具有抑制蛋白酶的生物活性，表现出抗炎、促进伤口愈合、抑制败血症等功能活性，在医学等领域应用前景广阔。

但是由于卵巨球蛋白在鸡蛋清中含量低，且不恰当的制备方法将使其丧失活性，因此如何纯化获得纯蛋白成为其研究的难题之一。目前，卵巨球蛋白的分离纯化均通过多步层析的方法获得，步骤繁多、耗时漫长，且多种填料的使用大大增加了生产成本。此外，在分离过程中，每一步骤的操作都将不可避免地导致目标蛋白不同程度的损失，由于操作步骤繁多，导致产品得率很低，仅为20%左右。因此，开发出一种操作简单、纯化周期短、得率高的卵巨球蛋白分离纯化方法，将具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述缺陷，提供一种简单、快速和高效的从鸡蛋清中提取卵巨球蛋白的方法。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种从鸡蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

（1）鸡蛋清溶液的制备

采用新鲜鸡蛋，将蛋清和蛋黄分开，收集鸡蛋清，边搅拌边向鸡蛋清中缓缓加入0.6～3倍体积的蒸馏水，加入完成后，继续搅拌2～3h，得鸡蛋清溶液；

（2）聚乙二醇分离

准确称取上述鸡蛋清溶液，按质量加入3～5%的聚乙二醇8000，搅拌2～3h，然后在8000～12000转/分的转速下离心8～15min，收集上清液，再向上清液中加入聚乙二醇8000，使聚乙二醇8000在上清液中的质量浓度达到8～10%，搅拌2～3h，然后在8000～12000转/分的转速下离心8～15min，收集沉淀；

（3）沉淀溶解与处理

将所得沉淀置于含有0.3～0.5M氯化钠的PBS缓冲液中，PBS缓冲液的体积是步骤（1）中的鸡蛋清体积的1/8～1/5，搅拌使沉淀溶解，再离心除去少量不溶物，取上清液待下一步纯化；

（4）凝胶过滤层析纯化

使用Sephacryl S-200HR作为凝胶过滤层析填料，装填后用PBS缓冲液对层析柱进行平衡，将第3步获得的上清液注入到层析柱中，用PBS缓冲液进行洗脱，收集第一个层析峰，即得卵巨球蛋白。

优选地，步骤（1）中所述蒸馏水的加入量是鸡蛋清体积的1倍。

优选地，步骤（2）中第一次加入的聚乙二醇8000是鸡蛋清溶液质量的3.2～4.4%，第二次加入的聚乙二醇8000在上清液中的质量浓度为8.4～9.2%。

进一步优选地，步骤（2）中第一次加入的聚乙二醇8000是鸡蛋清溶液质量的4%，第二次加入的聚乙二醇8000在上清液中的质量浓度为8.8%。

优选地，步骤（4）中的洗脱流速为0.5～0.8mL/min。

进一步优选地，步骤（4）中的洗脱流速为0.65～0.75mL/min。

本发明的有益效果在于：

（1）根据鸡蛋清蛋白质的特点设计卵巨球蛋白的提取方案：首先根据卵黏蛋白溶解度差的特点，采用聚乙二醇沉淀法将其除去，再利用卵巨球蛋白与其它蛋清蛋白质分子量上的巨大差异采用凝胶过滤层析将其纯化。过程中仅使用了一步层析，大大简化了操作，同时也降低了购买层析填料的成本。

（2）整个方法过程仅需10～12小时即可完成，与现有方法2～3天的周期相比，大大缩短了时间，提高了效率，降低了人工和时间成本。

（3）所得卵巨球蛋白样品纯度达到95.98%，在保持高纯度的同时，回收率也大幅提高，回收率从现有方法的约20%提高至61.4%，充分利用了蛋清蛋白质资源。

附图说明

图1为卵巨球蛋白分离纯化流程图；

图2为凝胶过滤层析图谱；

图3为卵巨球蛋白SDS-PAGE电泳图；

图4为卵巨球蛋白高相液相色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细地说明。

实施例1

一种从鸡蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

（1）鸡蛋清溶液的制备

取当天产出的新鲜鸡蛋，人工打蛋，使用分离器将蛋清和蛋黄分开，收集鸡蛋清，边磁力搅拌边向鸡蛋清中缓缓加入等体积的纯水，加入完成后，继续磁力搅拌3h，得鸡蛋清溶液。