[发明专利]一种具有启动苜蓿质体蓝素特异表达的光诱导启动子及一对快速克隆该启动子的引物

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种具有启动苜蓿质体蓝素特异表达的光诱导启动子序列及一对快速克隆该启动子的引物。

 

背景技术

利用转基因植物作为生物反应器，将外源基因导入植物中表达外源重组蛋白，生产药用蛋白或疫苗成为转基因植物研究的热点。但是外源基因在受体植物表达过程中，往往会出现表达效率低、表达产物不稳定、甚至基因失活或沉默等不良现象，导致转基因植物无法投入实际应用。因此，常常需要构建一种能高水平表达异源蛋白质的表达载体。为了更好的增加外源基因的表达活性，植物表达载体中的启动子起关键作用，其对外源基因的表达水平影响很大，是植物基因工程表达载体的重要元件。在双子叶植物遗传转化研究中多使用花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子，在这种组成型启动子的控制下，外源基因在植物的所有部位和每个发育阶段都会表达。然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达，往往会引起植物的变异，影响植物的正常生长发育。而对于植物特异诱导型启动子能调控外源基因在转基因植物体内表达的时空秩序特异性或外源诱导因子特异性，一方面能提高外源基因的表达效能及水平；另一方面可以节省生物能耗，减少外源基因对植物本身的影响。

目前植物启动子常用的克隆方法有：利用启动子探针载体筛选启动子、利用PCR技术克隆启动子、环状PCR、利用接头连接介导的PCR散步法、TAIL-PCR。近年来人们大多采用PCR方法克隆植物基因启动子。根据已经发表的基因序列设计引物，克隆所需基因的启动子。该方法简便、快捷、操作简单。

发明内容

    本发明的目的在于提供一种具有启动苜蓿质体蓝素特异表达的光诱导启动子序列及一对快速克隆该启动子的引物。此苜蓿质体蓝素启动子具有TATAbox、CAATbox等启动子必需元件、与光应答有关的特异元件G-box (ctttatca)及与组织特异性表达有关的GT1基序(aatccaca)等9个特异元件；并已通过试验验证此启动子具有一定光诱导特异性及叶片组织特异性，可驱动报告基因GUS在转基因苜蓿叶片中特异表达。该引物是参照蒺藜苜蓿基因组相关序列而设计的特异性引物适用于采用PCR方法快速克隆苜蓿质体蓝素启动子。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

本发明的启动子具有如图1所示的序列：

该启动子序列包括苜蓿质体蓝素编码基因起始密码子ATG上游共719bp。在起始密码子ATG上游大约-97bp和-118bp位置有TATA-box和CAAT-box，其参与决定转录的方向，指导RNA聚合酶结合到启动子上，使其在正确的位置开始转录，是大部分植物启动子正确转录必须的；在启动子上游部分还包含了9个与光诱导有关的调控元件。LAMP-element 是质体蓝素启动子的保守序列，也是光诱导启动子的标志性序保列，并且位置通常临近于TATA-box上游。 GT1-motif 则是一种组织特异性启动子的守序列，其控制基因在植物的叶片中表达，这个元件也与光诱导表达有一定的关系。Box II 是GT-1蛋白的集合位点，其是在豌豆rbcS-3A 基因启动子中被发现的，被认为是一种光诱导表达元件。Pc-CMA2a，Pc-CMA2b， Pc-CMA2c 这3个元件才、构成了一个大的质体蓝素保守DNA排列（Pc-CMA）并且与光诱导调控相关。之后的G-box，ATCT-motif，GAG-motif，也都通过文献报道确定其为与光诱导有关的调控元件。 

本发明的启动子通过如下方法得到：

（1）PCR法克隆启动子序列；包括a)反应体系；b)反应条件；c)双向引物；其特征是：a)灭菌去离子水33.75ul，苜蓿基因组DNA5ul，10×PCRbuffer5ul，dNTPmix4ul，上、下游引物各1ul，rTaq0.25ul，b)预变性95℃2min，变性95℃30s，退火53℃30s，延伸72℃1min，循环30次，延伸72℃10min，c)上游引物5’-CCCAAGCTTAAAATAATAATGTGTGTTATGAGA-3’，下游引物5’-cgggatccgctctgacacaaagcctt-3’。

（2）琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物并送交基因公司测序并分析序列。