[发明专利]鉴别肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌及鸡伤寒沙门氏菌的多重PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多重PCR检测沙门氏菌不同血清型的方法，主要涉及的血清型为肠炎沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌，鸡白痢沙门氏菌及鸡伤寒沙门氏菌。 

背景技术

沙门氏菌（Salmonella）是一类常见细菌的总称，其中有的只引起人发病，有的只引起动物发病，也有一些对人和动物都致病。沙门氏菌病（Samonellosis）是指由各种类型的沙门氏菌所引起的对人类、家养动物以及野生动物不同形式的疾病总称。 

猪、禽、犬、猫感染沙门氏菌后，可引起胃肠炎、流产、败血症等症状。随着动物集约化饲养规模的扩大，以及抗菌药物在临床和动物饲料中的广泛使用，沙门氏菌耐药性日趋严重，在多种动物中的感染率逐渐上升，引起的经济损失巨大。因此，对动物沙门氏菌病的及时诊断和净化对疾病的预防和降低经济损失十分重要。沙门氏菌可污染肉、蛋、奶等食品，使人发生食物中毒。据统计，全球人类各种细菌性食物中毒病中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。因此，该病在人医、兽医和公共卫生上均有十分重要的意义，因此，建立一种快速准确的检测沙门氏菌的技术，能够及时确定病原体，有利于人们及时采取有效防控措施，对于减少养殖场经济损失具有重要意义。 

近年来，PCR方法在沙门氏菌的检测中得以广泛的应用，该方法可以弥补沙门氏菌经典检测方法的不足，而且具有良好的特异性和敏感性。1992年，Rahn等首先设计出一对引物，用PCR检测沙门氏菌，检出率为97%，之后，PCR技术被广泛地应用于有害微生物的检测。目前，用于沙门氏菌PCR检测的引物主要分为三类：属特异基因引物、血清群特异基因引物和血清型特异基因引物。属特异基因是沙门氏菌属中的保守序列，该序列的有无是判断菌株是否属于沙门氏菌的依据。沙门氏菌的PCR快速检测方法通常是基于属特异性基因的基因序列，其属特异基因主要有hut基因（编码组氨酸转运操纵子）、inv基因簇(编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白)、hil基因(编码侵袭基因正调节蛋白)、fim基因(编码I型菌毛主要的亚单元)、hns基因(编码与蛋白质结合的DNA)、spv基因(编码沙门氏菌毒性质粒相关的毒力因子)和16SrRNA基因（核糖体重要组成部分）。Rahn K等、Stone G G等，卢强等均证实基于inv基因簇设计的引物具有属特异性，可用于鉴别沙门氏菌。细菌的rRNA是细胞内含量最多的RNA，约占RNA总量的80%以上，其分子量大，种类多，由高度保守区和可变区组成。细菌的rRNA包括5S、16S、23S，其中5S rRNA信息量少，不适合分析。23S rRNA尽管分子大，信息量多，但碱基突变速度较快，同样不适用于细菌鉴定。相比之下16S rRNA的遗传较为稳定，长度在1550±200bp左右，代表信息量适中，是研究系统进化的好材料。目前已经报道了10,000 种以上的细菌16S rDNA序列。通过对16S rDNA的序列分析，也可以用于沙门氏菌的初步鉴定。 

随着分子技术的发展，在PCR的基础上发展了多重PCR(multiplex PCR，mPCR)技术，多重PCR在食源性致病菌的检验上已得到较好应用，可以同时检测一种致病菌的多个基因，也可以同时检测多种致病菌。如Soo Jin Yang等建立了鉴定动物源性多重耐药的鼠伤寒沙门氏菌及肠炎沙门氏菌的多重PCR；Chai Fung Pui等建立了检测伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的多重PCR方法；Min-Su Kang等建立了鸡肠道沙门氏菌中鸡白痢和鸡伤寒及鸡伤寒活疫苗株9R鉴定的多重PCR方法。该技术弥补了沙门氏菌经典检测方法的不足，而且具有良好的特异性和敏感性。我们根据沙门氏菌属特异性基因hut设计一对引物，另外，根据肠炎沙门氏菌（SdfⅠ），鼠伤寒沙门氏菌（SPY），鸡白痢沙门氏菌(glgc)，鸡伤寒沙门氏菌(glgc和Spec)的血清型特异性基因分别设计一对引物。建立的多重PCR可同时检测鉴定出病原是否为肠炎沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌，鸡白痢沙门氏菌及鸡伤寒沙门氏菌。 

发明内容

本研究对检测沙门氏菌的PCR方法进一步探索，在其他人研究的属特异性及血清型特异性的基础上，针对四种禽类常见血清型的特异性基因设计出属和型特异性引物，建立了多重PCR的检测方法。该方法在同一个PCR反应体系中不仅可以快速鉴定出沙门氏菌，而且可以确定是否是肠炎沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌，鸡白痢沙门氏菌还是鸡伤寒沙门氏菌。