[发明专利]基于均相时间分辨荧光的检测重金属含量的方法

权利要求书

1.一种基于均相时间分辨荧光的检测重金属含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1. 将含有Eu³⁺离子的铕穴状化合物与300nM的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺溶液和300nM 的N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液搅拌混合活化30min形成第一活化混合液；

步骤2. 将50nM木瓜蛋白酶与所述第一活化混合液搅拌混合在20℃~30℃的条件下偶联反应形成Eu³⁺盐修饰的木瓜蛋白酶，所述含有Eu³⁺离子的铕穴状化合物和木瓜蛋白酶的摩尔比例为1：5，所述含有Eu³⁺离子的铕穴状化合物与1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔比例为1：2~5；

步骤3. 将荧光染料XL665与300nM的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺溶液和300nM 的N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液搅拌混合活化30min形成第二活化混合液；

步骤4. 将50nM木瓜蛋白酶与所述第二活化混合液搅拌混合在20℃~30℃的条件下偶联反应形成荧光染料XL665修饰的木瓜蛋白酶，所述荧光染料XL665与步骤4中木瓜蛋白酶的摩尔比例为1：5，所述荧光染料XL665与1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔比例为1：2~5；

步骤5. 将所述Eu³⁺盐修饰的木瓜蛋白酶与荧光染料XL665修饰的木瓜蛋白酶充分混合形成荧光检测液；

步骤6. 将所述荧光检测液加入待检测水溶液后经的激发光源激发从而检测在620nm和665nm波长的荧光发射强度，并计算665nm荧光发射强度与620nm荧光发射强度比值获得待测液荧光比值；

步骤7. 将待测液荧光比值与标准荧光曲线对比从而获得待检测水溶液中重金属离子的浓度，所述标准荧光曲线为基于若干种已知重金属浓度的标准溶液和所述荧光检测液获得的液荧光比值标定出的荧光曲线。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述Eu³⁺盐修饰的木瓜蛋白酶与荧光染料XL665修饰的木瓜蛋白酶按照1：1摩尔比充分混合。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2中所述Eu³⁺盐修饰的木瓜蛋白酶经透析袋过滤获得纯化后的Eu³⁺盐修饰的木瓜蛋白酶。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4中所述XL665修饰的木瓜蛋白酶经透析袋过滤获得纯化后的XL665修饰的木瓜蛋白酶。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述重金属包括Hg²⁺、Cu²⁺、Pb²⁺。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1~4的搅拌速率为300rpm。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤6中激发光源产生的光源波长为360nm。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2、步骤4中偶联反应的时间为2h。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2、步骤4中偶联反应的温度为25℃。