[发明专利]一种抑制木质素合成的植物RNA干扰载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抑制木质素合成的植物干扰载体的构建及其在培育低木质素含量植物中的应用。

背景技术

木质素是植物体内一类重要的大分子酚类聚合物，其数量巨大，在自然界中的含量仅次于纤维素，居有机多聚物的第二位，通常占植物体干重的10% 左右，在树木甚至可以达到30%。木质素在陆生植物的生长发育中起着及其重要的作用。然而，牧草中木质素过量的沉积却影响牲畜对牧草中营养成分的吸收；工业用植物中的木质素也加大了利用植物纤维的成本。因此，在畜牧生产和植物纤维利用工业中一直希望获得木质素含量低的新植物品系，从而改善牧草的营养特性或是降低工业生产成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制木质素合成的植物RNA干扰载体，该干扰载体含有部分紫花苜蓿CCoAOMT (咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶)基因序列。CCoAOMT是木质素合成关键酶之一，编码CCoAOMT的基因为CCoAOMT 基因。

本发明的另一个目的是提供一种抑制木质素合成的植物RNA干扰载体的制备方法。

本发明的另一个目的是提供一种抑制木质素合成的植物RNA干扰载体在培育低木质素含量植物中应用，为培育低木质素含量牧草等提供良好素材。

本发明的另一个目的是提供一种将构建的干扰载体转入植物细胞的方法，利用该方法，将该干扰载体转入植物细胞，经培养获得生长正常的低木质素含量植株。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：一种抑制木质素合成的植物RNA干扰载体，所述的植物RNA干扰载体是：将序列表SEQ ID NO.1所示的核酸序列作为正向核酸片段和序列表SEQ ID NO.2所示的核酸序列作为反向核酸片段插入植物表达载体pFGC5941中。序列表所示的核酸序列为插入了酶切位点的紫花苜蓿CCoAOMT片段。

上述的抑制木质素合成的植物RNA干扰载体的构建方法，包括以下步骤：

1)      紫花苜蓿总RNA的提取

2)      反转录获得紫花苜蓿cDNA；

3)      带有相应酶切位点的，分别作为正向核酸片段和反向核酸片段的紫花苜蓿CCoAOMT核酸序列的PCR扩增；

4)      PCR扩增的正向核酸片段和反向核酸片段经过切胶回收，分别连接到T 载体上；

5)      双酶切连接到T载体上的正向核酸片段和植物表达载体pFGC5941，电泳回收目的片段，T4连接酶连接，获得中间载体pFGC5941-CCoAOMT1；

6)      双酶切连接到T载体上的反向核酸片段和pFGC5941-CCoAOMT1，电泳回收目的片段， T4连接酶连接，获得植物RNA干扰载体pFGC5941-CCoAOMTi。

将植物RNA干扰载体——pFGC5941-CCoAOMTi质粒转入根癌农杆菌中，获得重组根癌农杆菌。

上述的植物RNA干扰载体在培育低木质素含量植物中的应用，其方法如下：

1)      转导过程采用叶盘法

取植物（如烟草或其它植物）健壮叶片，剪成0.5㎝²左右的叶盘，在分化培养基中预培养2d后，放入上述的含有植物RNA干扰载体pFGC5941-CCoAOMTi的重组根癌农杆菌中浸泡10min，取出后接种到分化培养基中，暗培养2d。转入筛选分化培养基，进行卡那霉素抗性筛选及不定芽的诱导。将诱导的不定芽从基部切下，转至生根培养基中生根。当根系发育完全，根长1.5～2.0cm时，移栽再生苗，获得转基因植株。

2)      转基因植株的PCR检测

提取转基因材料基因组DNA，以基因组DNA为模板，35S启动子加序列表SEQ ID NO.1所示的正向基因片段为检测目标，进行PCR反应；PCR产物测序、比对。通过该方法筛选阳性转基因植株。

上游引物：5’— GCACGACACTCTGGTCTACTC—3’

下游引物：5’— TTATTTAATGGGCTAAAAATGGTT—3’ 。

3)      生长正常的低木质素含量植株的获得

转基因植株木质素含量的测定：通过经典的Klason法测定样本木质素的含量。筛选木质素含量较野生型降低10%以上的材料继续培养。