[发明专利]一种植物表达载体及其构建方法和应用有效

申请号：	201310079547.0	申请日：	2013-03-13
公开（公告）号：	CN103409459A	公开（公告）日：	2013-11-27
发明（设计）人：	季静;王罡;吴疆;刁进进	申请（专利权）人：	天津大学
主分类号：	C12N15/82	分类号：	C12N15/82;C12N15/66;C12N1/21;A01H5/00
代理公司：	天津市杰盈专利代理有限公司 12207	代理人：	王小静
地址：	300072***	国省代码：	天津;12
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摘要：
搜索关键词：	一种植物表达载体及其构建方法应用
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【权利要求书】：

1.一种植物表达载体，其特征在于按照包括如下步骤的方法得到：出发表达载体为pGreenII0229和pCAMBIA3300-35S-HAK，分别用引物从pGreenII0229上克隆两个片段分别为1#和2#片段，分别含有LB和RB；从pCAMBIA3300-35S-HAK上克隆35S-NOS片段为3#片段；以质粒pGH-X6145G为模板克隆4#片段，最后将这4个片段连接在一起，构建成新的植物表达载体pJWW0230；

其中，RB位于从pGreenII0229克隆的1#片段5’端下游，LB位于从pGreenII0229克隆的2#片段中部；所述1#片段如序列SEQ ID NO：1所示；所述2#片段如序列SEQ ID NO：2所示；所述3#片段如序列SEQ ID NO：3所示；所述RB如序列SEQ ID NO：4所示，所述LB如序列SEQ ID NO：5所示；所述凝血酶基因如序列SEQ ID NO：6所示；所述大豆蛋白肽基因如序列SEQ ID NO：7所示；连接4#片段测序结果如序列SEQ ID NO：8所示。

2.一种植物表达载体，其特征在于按照包括如下步骤的方法得到：

（1）用1#F引物和1#R引物克隆pGreenII0229的1#片段，两端分别带有Not I和MIU I的酶切位点，切胶回收2kb片段；用2#F引物和2#R引物克隆pGreenII0229的2#片段，两端也分别带有Not I和MIU I的酶切位点，切胶回收1600kb片段；

（2）用Not I和MIU I酶切回收的1#和2#片段，连接这两个片段，得到载体pJWW-12；

（3）用3#F引物和3#R引物克隆pCAMBIA3300-35S-HAK上的3#片段，切胶回收3#片段，两端带有Xho I酶切位点；

（4）用Xho I分别酶切pJWW-12和3#片段，连接切开的载体和3#片段，得到载体pJWW-123；

（5）用4#F引物和4#R引物从pGH-X6145G克隆4#片段，其中含有多克隆位点，切胶回收300bp片段；

（6）用Sac I分别酶切载体pJWW-123和4#片段，连接切开的载体和4#片段，得到载体pJWW0230。

3.权利要求1或2所述表达载体在大肠杆菌转化中的应用。

4.权利要求1或2所述表达载体在农杆菌介导的植物遗传转化中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物为小麦、玉米或水稻。

6.权利要求1或2所述表达载体在植物育种中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述植物为小麦、玉米或水稻。