[发明专利]一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法

权利要求书

1.一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法，其特征在于：它以养殖动物、养殖水体和底泥为菌源分离出乳酸菌菌株；然后将分离出的乳酸菌菌株进行纯化选育出2-5株溶钙圈大，生长快，活力强的乳酸菌菌株；接着将进行纯化选育后选育出的乳酸菌菌株扩大培养，制备复合种子液；最后将复合种子液接种发酵即得复合型乳酸菌微生态制剂。

2.根据权利要求1所述的一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述纯化选育出的乳酸菌菌株为四株。

3.根据权利要求2所述的一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述的乳酸菌菌株进行纯化采用灭菌的MRS液体培养基，进行富集培养，将富集的菌液涂于MRS斜面上，分离出在含碳酸钙的MRS固体培养基上溶钙圈大的菌株若干株，经过两次分离纯化后待用；将分离纯化后的若干株乳酸菌菌株分别接种于灭菌的MRS液体培养基中，在30℃-37℃温度下培养46-50小时后吸取菌液在5000rpm下离心10-15min，弃去上清液保留菌体，向菌体中注入95%的生理盐水得到稀释菌液，然后用紫外分光光度计测定稀释菌液OD_543mn的吸光度，当所有稀释菌液的吸光度值相同时，把所有的稀释菌液按相同的体积比3-5%分别接种于灭菌的MRS液体培养基中，30℃-37℃下静置培养24-48h，然后用紫外分光光度计测定稀释菌液的OD_543nm，选出的OD_543nm测定值高的菌株；然后把这些菌株的培养液在室温下继续放置10天，后用MRS固体培养基进行平板计数，培养时间为24-48h,温度为30℃-37℃，选出计数结果高的菌株，最终选出4株乳酸菌菌株分别保种。

4.根据权利要求3所述的一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述MRS液体培养基的重量份组成为：大豆蛋白胨0.5-1.5份，牛肉膏0.5-1.5份，酵母浸粉0.2-0.6份，葡萄糖1.5-2.5份，磷酸氢二钾0.1-0.3份，乙酸钠0.3-0.7份，柠檬酸三铵0.1-0.3份，硫酸镁0.05-0.06份，硫酸锰0.02-0.03份，吐温0.05-0.15份，蒸馏水99-101份。

5.根据权利要求4所述的一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述的含碳酸钙的MRS固体培养基是在MRS液体培养基中按蒸馏水的重量加入1.5-1.8%的琼脂粉和1-1.2%的碳酸钙。

6.根据权利要求2所述的一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述的将进行纯化选育后选出的四株乳酸菌菌株扩大培养，制备复合种子液为：将四株来源不同的乳酸菌菌株进行平板划线，挑取单菌落接入灭菌的MRS液体培养基中进行扩大培养，在30℃-37℃下培养36h-48h，然后将四种培养液按体积比例10%，30%，30%，30%混合，然后接种于灭菌的MRS液体培养基中，接种量为5-20%，在30℃-37℃下混合培养24-48h获得复合种子液。

7.根据权利要求6所述的一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述平板划线所用的培养基为MRS固体培养基。

8.根据权利要求2所述的一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述的将复合种子液接种发酵为：将复合种子液接种到液体发酵培养基中，待搅拌均匀后密封在室温下发酵3-5天，在密封发酵过程中每天搅拌两次，并释放气体，同时在发酵过程中抽样1-2次，用平板计数法观察菌体的生长及杂菌率，并且测定pH值，当活菌数到达5×10⁸CFU/mL,杂菌率≦5%，pH值在3.0-4.0的条件下停止发酵，即得复合型乳酸菌微生态制剂。

9.根据权利要求8所述的一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述液体发酵培养基的重量份组成为：蔗糖0.5-1份，酵母膏0.2-0.5份，乙酸钠0.2-0.5份，磷酸氢二钾0.05-1份，柠檬酸三铵0.1-0.5份，硫酸镁0.058-0.065份、硫酸锰0.020-0.025份，吐温0.05-0.1份，蒸馏水99-101份。

10.根据权利要求9所述的一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述液体发酵培养基的重量份组成为：蔗糖0.8份，酵母膏0.4份，乙酸钠0.3份，磷酸氢二钾0.5份，柠檬酸三铵0.3份，硫酸镁0.06份、硫酸锰0.023份，吐温0.08份，蒸馏水100份。