[发明专利]旋毛虫AN1型锌指蛋白-2B重组蛋白抗原及其制备方法

说明书

 

技术领域：

本发明提供了一种旋毛虫AN1型锌指蛋白-2B重组蛋白抗原及其制备方法，涉及旋毛虫与H7402肝癌相关抗原基因AN1型锌指蛋白-2B抗体，本发明还提供了该抗体的医用用途，属于生物制药领域。

背景技术：

旋毛虫是一种毛尾目，毛形科的旋毛形线虫(Trihinella spiralis），可感染包括人在内几乎所有哺乳动物，是一种危害较严重的人兽共患病。最近研究发现，旋毛虫感染可提高宿主对肿瘤的抵抗力，但对其抗肿瘤活性成分尚不清楚。据报导异体抗原物所产生的抗体及免疫细胞对恶性肿瘤具有抵抗作用。旋毛虫与肿瘤细胞间相关抗原产生的抗体可针对肿瘤细胞引发较强的特异性和非特异性免疫反应。

发明内容：

本发明提供了一种旋毛虫AN1型锌指蛋白-2B基因（以下简称：旋毛虫AN1基因），为旋毛虫与H7402肝癌相关抗原基因，是一种新的蛋白基因物质，其抗体具有抗肿瘤生物活性。

本发明提供了旋毛虫AN1型锌指蛋白-2B基因的制备方法。

本发明提供了旋毛虫AN1型锌指蛋白-2B基因重组蛋白抗原。

本发明还提供了旋毛虫AN1型锌指蛋白-2B基因重组蛋白抗原的制备方法，用于制备治疗肿瘤的药物。

本发明进一步公开了旋毛虫AN1型锌指蛋白-2B基因重组蛋白抗原的抗体在制备抗肝癌药物中的用途。

本发明公开旋毛虫AN1基因，基因序列如SEQ no.1所示。

本发明用于扩增旋毛虫AN1基因的扩增引物，具有以下序列：

上游引物  CGCGAATTCATGGAATTTCCTAATTTAGA   EcoRⅠ

下游引物  CCGCTCGAGTCAAGATATAAGGCAGTTTC     XhoⅠ。

本发明所述旋毛虫AN1基因的获取方法如下：

分别制备旋毛虫和H7402肝癌细胞的抗血清,利用间接ELISA方法确定H7402肝癌细胞抗原与旋毛虫阳性血清、旋毛虫抗原与H7402肝癌细胞阳性血清间存在相关抗原；利用western blotting方法确定H7402肝癌细胞抗原和旋毛虫抗血清间具有交叉反应的分子大小，利用H7402肝癌高免血清对旋毛虫cDNA表达文库进行免疫筛选获得与H7402肝癌相关的抗原蛋白基因。设计特异性引物，利用PCR扩增目的基因。

本发明公开的旋毛虫AN1重组蛋白抗原，其特征在于：

利用分子量和等电点推测软件得到，旋毛虫AN1基因蛋白分子量约为24.1KD,等电点约为7.82。应用DNAStar软件对公开的旋毛虫AN1蛋白的抗原表位进行预测,该蛋白存在六个潜在的抗原表位，区域为：63-77，81-90，129-144，160-170，174-180，191-218。

本发明所述的旋毛虫AN1重组蛋白抗原的制备方法，包括以下步骤：

将PCR产物与pMD-18T连接，双酶切重组克隆质粒pMD-18T-AN1和表达载体pET-28a(+)，回收并连接旋毛虫AN1基因片段和pET-28a(+)载体片段，将连接产物转化到大肠杆菌Top 10中。挑取阳性菌落，摇菌，提取质粒，进行PCR和双酶切鉴定。

本发明所述的旋毛虫AN1重组蛋白抗原的抗体的制备方法，包括以下步骤：

用纯化复性的原核表达蛋白免疫小鼠,获得相关抗原基因蛋白的抗体血清。旋毛虫与H7402肝癌细胞相关抗原蛋白抗体能对H7402肝癌产生强的抑制作用,且获得的旋毛虫与H7402肝癌细胞相关抗原蛋白抗体易于制备和工业化生产。

本发明旋毛虫AN1重组蛋白抗原的抗体在制备抗肝癌药物中的用途。

本发明的积极效果在于：提供了旋毛虫AN1型锌指蛋白-2B基因，并提供了该基因抗体的制备方法，分别制备旋毛虫和H7402肝癌细胞的抗血清,利用间接ELISA方法确定H7402肝癌细胞抗原与旋毛虫阳性血清、旋毛虫抗原与H7402肝癌细胞阳性血清间存在相关抗原；利用多克隆抗体从旋毛虫cDNA文库中免疫筛选获得与H7402肝癌相关的抗原蛋白基因。克隆并原核表达相关蛋白，纯化复性其原核表达蛋白作为免疫原免疫小鼠，获得相关抗原基因蛋白的抗体。旋毛虫AN1重组蛋白抗原的抗体能对H7402肝癌产生强的抑制作用,且获得的旋毛虫AN1重组蛋白抗原的抗体易于制备和工业化生产。