[发明专利]一种耐化学农药噬菌核霉的筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及对核盘菌菌核具有强寄生，高致腐的、化学农药耐受的噬菌核霉的抗药性诱变、分离筛选、鉴定的方法。

背景技术

核盘菌【Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary】是一种世界性分布的植物病原真菌，寄主范围十分广泛，能侵染包括油菜、大豆、花生、向日葵、莴苣、白菜、胡萝卜等重要经济作物在内的75科278属408种及42个变种或亚种的植物，给农业生产带来了巨大的经济损失。以油菜为例，据不完全统计，我国每年油菜菌核病发病面积约270万公顷，占全国油菜栽培面积的70％。油菜感病后严重的减产可高达80％以上，含油量降低1％-5％。同时近几年温室作物的大面积推广，温室内的温湿度有利于菌核病的流行，蔬菜菌核病的发生也日益严重而且一年多次发生，从而大大降低了蔬菜的产量和质量。

核盘菌具有寄主范围广、顽固存活和子囊孢子气传等流行特点，所以将核盘菌引起的菌核病当作顽固性病害看待。在生产上一般采取推广抗(耐)作物品种、栽培防治、化学防治和生物防治等综合措施来防治油菜菌核病。下表为各种防治措施优缺点的比较：

现阶段我国在防治菌核病的方面所采取的措施绝大多数为化学防治，然而由于化学农药的长期大量施用，使植物病原菌产生抗药性，因而增加了农药的使用量与防治次数，大大提高了防治费用与成本，同时导致了各种环境和健康问题。因此，使用安全、高效的生物防治方法已成为现如今解决植物病虫害最为理想的措施。核盘菌的生物防治就是根据核盘菌侵染时需要外源营养和菌核长期存活等特点，利用一些拮抗微生物(antagonist)和重寄生菌(hyperparasite)可从抑制核盘菌侵染和影响菌核存活的角度防治菌核病。目前的研究表明噬菌核霉对核盘菌具有作用专一性强，作用时间久，对植物无致病性等特点，因而被认为是最具开发潜力的防治菌核病的生防菌之一。

噬菌核霉(Coniothyrium minitans)又名盾壳霉，首次有美国学者Campbell(1947)描述和命名，是核盘菌的重寄生菌，广泛分布于核盘菌发生的地区，它主要通过破坏性侵入和寄生在核盘菌的菌丝体和菌核中，并在其细胞内和细胞间生长发育，继而形成菌丝体和分生孢子，从而导致病原菌菌丝体的细胞死亡、分解，进而降低菌核形成数目和萌发力，最终达到防治该病的目的。然而研究表明噬菌核霉并不能有效防治核盘菌的初侵染，且单独使用效果不稳定，因此，将生防菌与杀菌剂混用即能提高防病效果，又能改善生防菌防效不稳定的状况。同时，还可减轻杀菌剂对病原菌造成的诱变压力。但是混用的前提是噬菌核霉必须对所使用的药物具有稳定的抗性。

发明内容

本发明的目的是筛选对不同化学农药杀菌剂具有稳定抗性的噬菌核霉突变株，从而能与杀菌剂联用防治菌核病。

本发明自无锡楗农生物科技有限公司、无锡瑞融生物医药有限公司前期从苏北土壤中分离、筛选到一株具有高致腐活性的噬菌核霉，申请人将其命名为噬菌核霉K1，经常规鉴定、分子鉴定为噬菌核霉，该菌株已送至中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)鉴定中心委托鉴定，证实为噬菌核霉，鉴定报告编号为(2012)微检字第106号。

噬菌核霉K1的菌学特征：

在PDA培养基上，菌落的菌丝初期为无色，随着菌落的生长呈白色绒状，背面也为白色，菌落产孢后呈黑色或由褐色转变为黑色，孢子器吐出黑色水滴，水滴中包含溢出的分生孢子。菌落扁平，边缘纤毛状。分生孢子梗聚集，有横隔，有分枝，直立，壁光滑。产孢细胞呈瓶状，簇生于分生孢子梗顶端。分生孢子为单细胞，呈椭圆形，表面粗糙，有不规则突起，大小约为7-12μm×3-5μm。最适生长温度为20℃，最适生长pH为6。

本发明将筛选得到的噬菌核霉K1作为出发菌株，通过紫外诱变的方法，筛选到四株具有稳定抗药性的突变株，分别是抗菌核净菌株2株(命名为UV-D1、UV-D2)，抗福美双菌株1株(命名为UV-T)，抗异菌脲菌株1株(命名为UV-I)，各自抗性杀菌剂对突变株的EC₅₀分别提高几百至上千倍不等。具体的诱变方法为：