[发明专利]新的融合标签进行水稻转基因快速筛选的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物育种领域，具体而言，本发明涉及带有融合标签的植物转基因转化载体及使用其的植物转基因的筛选方法等。

背景技术

植物（尤其是水稻）转基因技术中最为繁琐的步骤是后期转化子（株）的筛选。目前主要借助标记基因筛选转化子，其中，标记基因主要分为2类：选择基因和报告基因。

选择基因主要包括抗生素抗性基因(如HPT基因，Gent基因等)和抗除草剂基因。然而，使用选择基因作为标记基因的筛选方法会有部分假阳性植株，还需要进一步提取植物基因组，借助PCR等方法检测。

常用的报告基因是β-葡萄糖苷酸酶基因(β-glucuronidase gene，gus)、gfp等。这些基因能够进行可视化筛选，但是主要问题是它们较大，导致T-DNA转化载体变大，转化效率降低，而为了提高转化效率不得不设计在不同启动子和/或终止子控制下的开放阅读框（ORF）。

更加困难的是，转基因植物往往背景复杂，有可能导入过多次外源基因，由于植物转基因常用启动子和终止子类型有限而且同源性较高，加之目的基因的同源性也较高，如果重复使用相同的启动子和终止子，可能会导致转化时发生遗传重组，尤其是保留了标签而失去了目的基因的同源重组，给后期高成本筛选带来了更大的难度，而要设计不同启动子和/或终止子控制，则更加难以在实践中操作。

为此，本发明人经过长期而艰苦的研究，凭借一些运气，发明了新的融合标签，兼有选择基因和报告基因的功能，既能对潮霉素具有抗性，又有可视化特性，在水稻遗传转化过程的愈伤筛选和转基因植株生长阶段都可以观察，大幅提高筛选正确性；而且，该标签较小，且仅需要一个启动子和一个终止子控制，无需设计多个启动子和/或终止子。尤其是，本发明人还在启动子和终止子的选择及序列作了新的优化，不同于现有技术的，配合本发明的融合标签使用，构建成的转化载体不容易发生同源重组，不容易发生仅保留标签的同源重组，从而使得筛选本身稳定，更能够快速有效的筛选和鉴定转基因阳性植株，尤其是水稻植株。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供新的带有融合标签的植物转基因转化载体，其标签较小，从而便于在一个启动子和一个终止子下就能控制较大的目的基因的转化，而且采用了可视化标签，更便于筛选，配合启动子和终止子，更能够快速有效的筛选和鉴定转基因阳性植株。另外，本发明还提供了新的植物转基因的筛选方法和植物转基因的方法等。

具体而言，在第一方面，本发明提供了带有融合标签的植物转基因转化载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

该载体是环形载体，即首尾的核苷酸是相连的，连接成环形。

该载体的多克隆位点有SacI、KpnI、SmaI、XmaI、Acc65I和BamHI等，足够满足作为植物转化载体之用。这些多克隆载体涵盖了常用且成本低的内切酶，与常用的克隆载体的酶切位点对应，为向植物转化目的基因提供了便利。

在第二方面，本发明提供了鉴定细菌体中带有在本发明第一方面所述的载体的方法，其使用聚合酶链反应（PCR）直接扩增细菌体，其中PCR引物对如下所示：

tttccttcctcttttctacagt，和

gtaatgcagaagaagaccatgg。

本发明第一方面所述的载体在菌体中克隆的过程中，尤其是成线形化的状态时，会有自连的情况发生，为此需要进行鉴定；但是，成为环形后就不会有自连情况发生。除了测序等高成本的方法，采用本发明第二方面的方法进行鉴定，是成本低且方便、快捷的手段。

当然，优选本发明第二方面的方法，其还进一步包括对PCR直接扩增细菌体呈阳性的菌体中载体进行测序的过程。

在第三方面，本发明提供了植物转基因的筛选方法，其包括，

（1）将需要转入植物的基因克隆入本发明第一方面所述的载体；

（2）转化入农杆菌；

（3）对植物愈伤组织进行转化；

（4）在含潮霉素的培养基中培养植物愈伤组织；和

（5）检测植物愈伤组织发出的荧光。

相应地，在第四方面，本发明还提供了植物转基因的方法，其包括，

（1）将需要转入植物的基因克隆入本发明第一方面所述的载体；

（2）转化入农杆菌；

（3）对植物愈伤组织进行转化；

（4）在含潮霉素的培养基中培养植物愈伤组织；和

（5）检测植物愈伤组织发出的荧光，保留检测阳性的愈伤组织。