[发明专利]禽衣阿华支原体LAMP可视化检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种禽衣阿华支原体LAMP可视化检测试剂盒。

背景技术

禽衣阿华支原体(Myeolasmaiowae MI)是危害火鸡最主要的支原体,其主要引起火鸡孵化率降低,胚胎死亡。近年来,随着火鸡饲养业的兴起,该病对火鸡饲养业的危害也越来越严重,而衣阿华支原体不同菌株间抗原差异较大,产生的抗体水平较低,传统的鸡支原体病血清学方法和分离培养技术已不能满足现代火鸡饲养业的需要,因此迫切需要建立一种快速、敏感、特异的检测禽衣阿华支原体的方法,目前MI-PCR技术已有报道。MI-PCR技术快速、敏感性高，但是需要使用昂贵的仪器和试剂等。

LAMP技术是一新型的核酸扩增技术，不需要特殊的仪器设备，仅在水浴锅中就可完成扩增反应，反应产物无需经过电泳就可以直接观察,肉眼可见阳性样品的反应液变成翠绿色，阴性样品的反应液则为桔红色。LAMP反应灵敏度很高，反应产物又易形成气溶胶污染环境，导致出现假阳性，因此应将配制反应体系的区域、加样区域与观察反应结果的区域进行严格分区，防止假阳性结果的出现。

环介导等温扩增技术(LAMP)是由Notomi等建立的新型核酸扩增技术，目前已广泛运用于一些病原微生物的检测中，目前，国内还没有应用LAMP检测禽衣阿华支原体的研究报导。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测禽衣阿华支原体的环介导等温扩增引物组。

本发明提供的引物组，包括引物1、引物2、引物3和引物4；

所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。

上述引物组中，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比为8：8：1：1。

上述引物组还包括引物5和引物6；所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列5和序列6；

所述引物组具体由所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6组成。

上述的引物组中，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比为8：8：1：1：4:4。

含有上述的引物组的检测禽衣阿华支原体的环介导等温扩增试剂也是本发明保护的范围。

上述环介导等温扩增试剂由上述的引物组、环介导等温扩增缓冲液、dNTPs、甜菜碱、MgSO₄、MnCl₂、钙黄绿素、DNA聚合酶和水组成。

上述环介导等温扩增试剂中，所述引物组中的引物1和所述引物2在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为1.6uM；

所述引物组中的引物3和所述引物4在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为0.2uM；

所述引物组中的引物5和所述引物6在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为0.8uM。

本发明的另一个目的是提供一种检测禽衣阿华支原体的环介导等温扩增试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的引物组或上述的环介导等温扩增试剂。

上述的引物组、上述的环介导等温扩增试剂或上述环介导等温扩增试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有禽衣阿华支原体的产品或制备检测和/或辅助检测禽衣阿华支原体的产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用采用环介导等温扩增，所述环介导等温扩增的条件具体为61℃反应1h，80℃作用10min灭活。

本发明的实验证明，本发明根据MI种特异的DNA保守序列设计了6条引物，通过优化反应条件后，建立了MI的LAMP检测方法。所建立的MI LAMP检测方法只在水浴锅中1小时即可特异的检测MI，有强的特异性，并且检测灵敏度非常高，最低检测到10fg的MI DNA样品，灵敏度是常规PCR的100倍。总之本发明发现的引物及所建立的MI LAMP检测试剂及方法具有快速、灵敏、特异、简便的特点，仅需使用一台能控温的水浴锅，并且结果可以无需仪器而仅通过肉眼判定，适合在边境口岸、食品厂、基层兽医站和养殖场中进行快速检测，因此用LAMP快速检测MI,对MI的有效防制有重要意义,具有较好的应用前景。

附图说明

图1为LAMP方法检测MI的特异性

图2为LAMP方法检测MI的敏感性

图3为PCR方法检测MI的敏感性

图4为LAMP方法检测待测样本是否含有MI

具体实施方式