[发明专利]融合蛋白NLS-I-SceI在制备介导哺乳动物基因转移的试剂中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及融合蛋白NLS-I-SceI及其编码的mRNA在制备介导哺乳动物基因转移的试剂中的应用。

背景技术

哺乳动物基因转移技术是对哺乳动物基因组进行遗传修饰、创制医学转基因动物模型和培育转基因动物新品种的重要手段。现有的创制转基因哺乳动物的主要技术有：胚胎细胞原核显微注射、基于体细胞核移植（SCNT）的转基因克隆、重组病毒载体感染、转座子介导基因转移和精子介导基因转移（SMGT）等。

胚胎细胞原核显微注射是将含目的基因序列的DNA片段导入动物受精卵原核，以实现转基因在基因组中的整合并由此获得转基因动物，是培育转基因哺乳动物的经典方法，但该技术效率很低。已有研究表明（Wall, et al. Therionology, 1996, 45:57），在胚胎细胞原核清晰度非常高的小鼠中，通过胚胎细胞原核显微注射研制转基因小鼠的效率（获得的转基因动物数/移植的胚胎数）平均仅为2.6%，所获得的首建动物中转基因阳性率低于10%。在小鼠以外的哺乳动物、尤其是大动物（如猪、牛、羊等）中，由于胚胎细胞原核清晰度差，基于胚胎细胞原核显微注射的转基因效率更低。例如，利用胚胎细胞原核显微注射制备转基因猪的效率一般低于1%（Hammer RE et al. Nature, 1985, 315:680）、部分报道中仅为0.3%（Matrin et al. Transgenic Research, 2005, 14:373），而首建猪中转基因阳性率一般低于5%。由于大动物购买、饲养及实验成本昂贵，该技术的低效率已严重制约了转基因大动物的规模化制备。

为了克服胚胎原核显微注射技术的不足，转基因克隆技术已被广泛地应用于转基因哺乳动物、尤其是大动物的制备。转基因克隆技术是以含有目的基因的转基因细胞为供核细胞，通过体细胞核移植将转基因供核细胞核导入去核的卵母细胞中，由此构建含有转基因的克隆胚胎，再通过克隆胚胎发育获得转基因个体。该技术由于以转基因细胞为供核细胞，理论上可实现首建动物100%的转基因阳性率。但是，由于克隆胚胎发育率低，导致转基因克隆效率（获得的转基因克隆动物数/移植的克隆胚胎数）很低（一般低于3%）（Dai et al. Nature Biotechnology; Lai et al. Science, 2002, 295: 1089; Kues et al. Trends Biotechnology, 2004, 22: 286）。其次，由于克隆动物经常会出现发育异常，导致转基因克隆动物围产期死亡率和夭折率均较高（可高达40%）。再次，由于转基因供核细胞的制备需要药物抗性筛选，导致获得的转基因克隆动物的基因组中含有药物抗性基因，存在生物安全隐患，限制了转基因动物的应用范围（如食品、生物材料及制品等）。此外，转基因克隆技术需要大规模采集动物卵母细胞，需要大量、稳定的卵巢来源，因此该技术只能常规应用于长期开展规模化屠宰的经济类动物（如猪、牛、羊等），不适用于非经济类模式动物（如犬、猴等）。

重组病毒载体（主要为基于HIV-1等逆转录病毒基因组改造的慢病毒载体）感染是高效的转基因动物制备技术，其转基因动物制备效率可达14-31%，首建动物转基因阳性率可达60-95%(Lois et al. Science, 2002, 295:868; Whitelaw et al. FEBS Letter, 2004, 571:233; Hoffman et al. EMBO Reports, 2003, 4:1054)，但该技术仍有诸多缺陷：首先，该技术需要高滴度的重组病毒颗粒悬液， 而高滴度病毒的包装、浓缩与纯化是复杂、繁琐的生物学过程，且生物安全度要求高；其次，重组病毒载体源自于致病的病毒基因组（如HIV-1），其存在着生物安全隐患，严重限制了转基因动物的应用。

转座子介导的转基因技术是有效的制备转基因动物的方法，但该技术需要在转基因载体中添加转座子元件，导致转基因整合至动物基因组后仍具备可移动性，仍然存在类似病毒载体的生物安全隐患。

精子介导基因转移技术被认为是简便和低成本的大动物转基因技术，但由于该技术重复性差、高度不稳定，导致其目前并未成为制备转基因哺乳动物的常规技术。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种融合蛋白NLS-I-SceI的应用，该融合蛋白能够特异识别I-SceI识别位点，将两端含有反向I-SceI识别位点的目标基因片段切下；本发明的目的之二在于提供编码上述融合蛋白NLS-I-SceI的mRNA的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：