[发明专利]大肠杆菌-链霉菌穿梭型BAC载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种大肠杆菌-链霉菌穿梭型BAC载体及其构建方法，具体涉及一种可由大肠杆菌接合转移至链霉菌并整合至其基因组的BAC载体及其构建方法，属于基因工程领域。

背景技术

链霉菌是微生物中产抗生素种类最多的种属，目前世界上发现的5000多种抗生素中，60%以上是由链霉菌合成的，作为抗生素的生产菌，链霉菌在传统发酵工业中的应用有着悠久的历史，而分子遗传学的发展则为链霉菌的基因重组展现了广阔的应用前景，自1980年首次报导链霉菌基因克隆以来，链霉菌基因工程日益兴起。

载体作为基因工程的重要工具是链霉菌基因工程首先遇到的问题。起初科学家们根据对一部分链霉菌遗传背景已有的认识，构建了一系列链霉菌质粒和噬菌体克隆载体系统，后来为了研究链霉菌基因功能和构建其基因文库，须将链霉菌基因转入大肠杆菌中进行一些遗传操作，然后再转移到某些模式链霉菌中作进一步研究，于是各个实验室纷纷开始构建大肠杆菌-链霉菌穿梭载体，文献记载最早的是1982年Richardson MA等构建的大肠杆菌-链霉菌双功能载体pFJ123，然后就是1989年Hill RT等构建的大肠杆菌-链霉菌正筛选穿梭载体pLR591，国内有关这方面较早的研究是谭华荣等1990年构建的链霉菌和大肠杆菌穿梭质粒载体pSE-3。

与此同时链霉菌基因转移系统也开始建立，文献记载较早的是原生质体转化法，包括PEG介导和脂质体协助，但在实际应用中常常遇到不少障碍，主要由于链霉菌特殊的结构特点，要么其原生质体难以制备，要么其难以被外源质粒所转化，还有电击转化法，效率也很低，自Trien-Cuot等人首次阐明大肠杆菌与许多革兰氏阳性细菌之间可进行质粒的接合转移的现象，两年后Mazodier发展了质粒在大肠杆菌和链霉菌之间进行接合转移的方法，即在大肠杆菌-链霉菌穿梭载体上引入接合转移顺式作用元件oriT，将其转化到携带RP4质粒的大肠杆菌中，载着目的基因的载体就在RP4上的反式作用元件tra的诱导下由大肠杆菌接合转移到链霉菌中去。这种方法不但易于操作，而且可避开链霉菌的甲基化限制作用，提高外源基因的存活率。

已有报导，重组质粒在链霉菌中显示结构的不稳定性，人们就尝试构建一种可整合至链霉菌基因组的载体，其中主要包括由Streptomyces ambofaciens质粒pSAM2衍生和链霉菌噬菌体衍生的载体，而衍生载体因有较高的转化效率而颇受偏爱，如pSET152就是由目前研究较热的链霉菌噬菌体ΦC31的整合系统衍生而来的，即在载体上引入attP序列（phage attachment site）和整合酶基因（int），整合酶可介导attP与链霉菌基因组内的attB（bacterial attachment site）间位点特异性重组，从而将整个载体包括外源基因整合进链霉菌基因组中，使外源基因在没有选择压力的情况下在链霉菌中稳定存在，这可作为其用于大规模生产的一个极大的优势。

链霉菌基因组测序完成后人们发现，在链霉菌基因组中与某一天然产物生物合成途径相关的基因往往成簇存在，因此都比较大（>60kb），要想完整地克隆这些基因簇就必须要有能装载大片段的载体。目前应用较广的大片段克隆载体有酵母人工染色体(YAC)和细菌人工染色体（BAC），BAC的插入片段不如YAC长，但其有很多优点可弥补YAC的不足，这就使得其应用和发展远远超过了YAC。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种大肠杆菌-链霉菌穿梭型BAC载体，本发明成功构建了一种可由大肠杆菌接合转移至链霉菌，并整合至其基因组的穿梭型BAC载体pBTIBAC11，以实现大片段基因簇在大肠杆菌中完成遗传操作后转移至链霉菌中异源表达。

本发明由大肠杆菌接合转移至链霉菌的BAC载体，其含有多克隆位点MCS，安普抗性基因Am，整合酶基因int，整合位点attp，接合转移位点oriT，BAC载体的复制区oriS、repA基因、sopA基因、sopB基因、sopC序列、cos位点和loxP位点。

多克隆位点（MCS），序列如SEQ NO.1；

安普抗性基因（Am），序列如SEQ NO.2；

整合酶基因（int），序列如SEQ NO.3；

整合位点（attp），序列如SEQ NO.4；

接合转移片段（oriT），序列如SEQ NO.5；

BAC载体复制区（oriS），序列如SEQ NO.6；

BAC载体的repA基因，序列如SEQ NO.7；