[发明专利]功能性流感病毒样颗粒（VLPs）

说明书

本申请是申请日为2004年07月09日、中国申请号为200480026152.3、发明名称为“功能性流感病毒样颗粒（VLPs）”的发明申请的分案申请。

发明背景

流感病毒是正粘病毒科的一员（参见Murphy和Webster，1996）。具有被称做A、B和C的三个流感病毒亚型。流感病毒粒子包含节段的负义RNA基因组。该流感病毒粒子包括如下蛋白：血凝素（HA）、唾液酸苷酶（NA）、基质（M1）、质子离子通道蛋白（M2）、核蛋白（NP）、聚合酶碱性蛋白1（PB1）、聚合酶碱性蛋白2（PB2）、聚合酶酸性蛋白（PA）、和非结构蛋白2（NS2）蛋白。HA、NA、M1和M2与膜结合，而NP、PB1、PB2、PA和NS2是核壳结合蛋白。NS1是唯一的不与病毒体颗粒结合但对流感感染细胞具有专一性的非结构蛋白。M1蛋白在流感病毒颗粒中是具最高丰度的蛋白。HA和NA蛋白是包膜糖蛋白，负责病毒附着和病毒颗粒侵入细胞，以及是病毒中和和保护性免疫的主要免疫优势表位的来源。HA和NA蛋白被认为是预防性流感疫苗最重要的成分。

流感病毒感染是由病毒体表面HA蛋白与含有唾液酸的细胞受体（糖蛋白和糖脂）附着引起的。NA蛋白介导唾液酸受体的加工，并且病毒侵入细胞取决于依赖HA的受体介导胞吞作用。在包含流感病毒粒子的内化核内体的酸性区域内，HA₂蛋白构象发生改变，导致病毒与细胞膜的融合以及病毒脱壳和M2介导的M1蛋白从核壳相关的核糖核蛋白（RNPs）释放，所述M1蛋白移入细胞核用于病毒RNA合成。HA蛋白的抗体通过中和病毒的传染性防止病毒感染，而NA蛋白的抗体调节它们对病毒复制早期步骤的影响。

现在，灭活的流感A和B病毒疫苗被许可用于肠胃外给予。这些三价体疫苗在受孕鸡卵的尿囊腔中产生，通过速率区带离心或柱层析纯化，用福尔马林或β丙酸内酯灭活，并配制成在一个计算年的人群中传播的流感病毒A型和B型两种株系的混合物。可购买的流感疫苗是全病毒（WV）或亚病毒体（SV；分离或纯化的表面抗原）病毒疫苗。该WV疫苗包含完整、灭活的病毒粒子。用例如三-正-丁基磷酸盐的溶剂处理的SV疫苗（Flu-Shield，Wyeth-Lederle）包含几乎所有的病毒结构蛋白和一些病毒被膜。虽然有残余量的其它病毒结构蛋白存在，用Triton X-100溶解的SV疫苗（Fluzone，Connaught；Fluvirin，Evans）主要包含HA单体、NA和NP的聚合体。最近，FDA许可潜在的冷适应活减毒流感病毒疫苗（FluMist，MedImmune）在市场上销售，用做鼻内给予的疫苗，指示用于自动免疫接种，预防在健康儿童和青少年（5-17岁）和18-49岁的健康成人中由流感A和B病毒引起的疾病。

已开发了一些重组产物作为重组流感疫苗候选物。这些方法集中于流感A型HA和NA蛋白的表达、生产和纯化，包括使用杆状病毒感染的昆虫细胞的蛋白（Crawford等，1999；Johansson，1999；Treanor等，1996）、病毒载体（Pushko等，1997；Berglund等，1999）和DNA疫苗构建物（Olsen等，1997）的表达。

Crawford等（1999）证明在感染杆状病毒的昆虫细胞中表达的流感HA能够预防由禽H5和H7流感亚型引起的致死性流感。同时，另一组研究人员证实杆状病毒表达的流感HA和NA蛋白诱导动物的免疫反应超过那些由常规疫苗诱导的反应（Johansson等，1999）。将杆状病毒表达的马流感病毒的血凝素的免疫原性和效能与同源DNA疫苗候选物相比（Olsen等，1997）。使用各种实验方法和在不同的动物模型中，合起来看，数据表明用重组HA或NA蛋白可诱导对流感病毒侵袭的高度的保护作用。

Lakey等（1996）显示来自杆状病毒的流感HA疫苗在志愿人群中的阶段I（Phase I）的剂量增加安全研究中具有很好的耐受性和免疫原性。然而，在用若干剂量包括HA和/或NA蛋白的流感疫苗接种的人类志愿者若干临床位点中进行阶段II研究的结果显示，重组亚单位蛋白疫苗不产生保护性免疫[G.SM1th，Protein Sciences；M.Perdue，USDA，Personal Communications]。这些结果表明在传染性病毒粒子的HA和NA包膜粒的表面显示的构象表位对于诱导中和抗体和保护性免疫很重要。