[发明专利]一种制备重组人干扰素α2b的发酵培养基及发酵方法

说明书

技术领域

本发明涉及医药领域，尤其涉及一种制备重组人干扰素α2b的发酵培养基及发酵方法。

背景技术

随着基因工程技术的发展，工程菌的发酵工艺得到极为广泛的应用，生物工程菌发酵的目的是获得大量的外源性的基因产物，尽可能减少宿主细胞及外来因素的污染，所以高密度、高产率高表达的培养已经成为发酵工业的目标和方向。在高密度表达方面，大肠杆菌是最具代表性及应用最广的宿主菌，大肠杆菌中重组蛋白表达方式有二种，一种为组成型表达，一种为诱导性表达，目前，在重组蛋白工程菌的高密度发酵培养中，大多为诱导性表达的菌种，其优点在于通过温度诱导或化学诱导，可使工程菌在短时间内迅速生长，达到高比生长速率，同时达到最大表达量，缺点在于在细菌迅速生长的过程中细菌的代谢产物也会迅速产生，如有机酸、二氧化碳等有害物质的迅速积累会抑制细菌的生长和产物的表达，而最大的副产物乙酸的产生 ，一般认为细菌在低比生长速率条件下，通过氧化代谢作用产生的能量中足以满足合成和异化作用的需求，不会产生乙酸，而在高比生长速率时，大肠杆菌仅靠氧化代谢不能提供足够的能量，必须通过乙酸生成途径储备ATP和NADH，这样就会过多产生乙酸，而酸的增加会对细菌繁殖及产物表达抑制作用，同时也会对后续提纯带来很大的负担。

大肠杆菌中重组蛋白的组成型表达方式是一种缓慢表达的方式，无需诱导，在细菌生长的过程中持续生长及表达，其生长周期内因没有诱导迅速生长的过程，生长速度均匀，代谢产物中乙酸含量低，可获得理想的产物表达率，但很难实现高密度培养。

因此，现有技术还有待于更进一步的改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种制备重组人干扰素α2b的发酵培养基及发酵方法，通过一种特定培养基及发酵过程的控制，实现组成型表达的重组人干扰素α2b工程菌的高密度培养及高效表达。

本发明的技术方案如下：

一种适用于组成型表达的重组人干扰素α2b工程菌的发酵培养基，其按照重量份其包括以下组分：

胰蛋白胨25-35份，酵母提取物15-25份，磷酸氢二钠4-8份，磷酸二氢钾2-4份，氯化铵0.4-0.6份，氯化钠0.4-0.6份，硫酸镁0. 2-0.4份，氯化钙0.05-0.15份与丙三醇10-20份。

所述的发酵培养基，其中，胰蛋白胨浓度为25-35 g/L，酵母提取物的浓度为15-25 g/L，磷酸氢二钠浓度为4-8 g/L，磷酸二氢钾浓度为2-4 g/L，氯化铵浓度为0.4-0.6g/L，氯化钠浓度为0.4-0.6 g/L，硫酸镁浓度为0. 2-0.4g/L，氯化钙浓度为0.05-0.15 g/L与丙三醇浓度为10-20g/L。

一种制备重组人干扰素α2b的发酵方法，其包括以下步骤：

A、按照重量份将胰蛋白胨25-35份，酵母提取物15-25份，磷酸氢二钠4-8份，磷酸二氢钾2-4份，氯化铵0.4-0.6份，氯化钠0.4-0.6份，硫酸镁0. 2-0.4份，氯化钙0.05-0.15份与丙三醇10-20份加入发酵罐中，并向所述发酵罐中加入注射用水充分混合得到培养基；

B、再向所述发酵罐中加入磷酸与50%的氢氧化钠溶液，调节所述培养基的PH值到7.0±0.2，然后再将工程菌菌种接种到所述培养基进行培养，所述发酵罐中培养温度为37℃，得到发酵产物；

C、将所述发酵产物采用低温离心法得到菌体，并对所述菌体进行裂解及一系列提纯，获得重组人干扰素α2b蛋白。

所述的发酵培养方法，其中，所述步骤B还包括：

B1、向所述发酵罐中加入所述磷酸，将所述培养基的PH值调节至4.2±0.2，并在121℃条件下灭菌15分钟；

B2、将灭菌后的所述培养基温度控制在37℃，然后向所述发酵罐中加入50%的氢氧化钠溶液，将所述培养基的PH值调整至7.0±0.2；

B3、发酵培养过程中向所述发酵罐中适时加入磷酸与50%的氢氧化钠溶液，控制所述培养基的PH值为7.0±0.2；随着细菌生长培养基的溶解氧自90%逐渐降低至零。

本发明提供了一种制备重组人干扰素α2b的发酵培养基及发酵方法，以丙三醇为唯一碳源，以适量磷酸盐浓度调整目的蛋白的表达速率，并将培养基于酸性条件下灭菌，减少灭菌时间以减少培养基营养成分的流失，培养过程中以50%的磷酸及50%氢氧化钠作为酸碱调节剂来调节发酵液的PH值，保证了工程菌良好的生长状态，实现了高密度培养和高效表达，本发明工艺简单，代谢副产物少，有利于表达产物的后续提纯，降低了重组人干扰素α2b的制造成本。