[发明专利]一种检测炭疽芽孢杆菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测炭疽芽孢杆菌的方法。

背景技术

炭疽是严重威胁人类健康的烈性传染病，其病原体为炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）。由于其高毒性，炭疽杆菌是一种潜在的生物武器，曾被帝国主义作为致死战剂之一。目前，皮肤炭疽在我国各地还有散在发生，不应放松警惕。因此，发展快速、灵敏的炭疽杆菌检测方法具有重要意义。

噬菌体裂解酶（bacteriophage lysins）是噬菌体在感染宿主菌末期表达的蛋白质，它通过水解细菌细胞壁的肽聚糖使子代噬菌体释放。γ噬菌体裂解酶（PlyG）能够特异性地杀死炭疽杆菌，同时也能够裂解蜡样芽孢杆菌RSVF1菌株，且RSVF1菌株是唯一对PlyG敏感的蜡样芽孢杆菌菌株。Miri Yemini等人就曾以RSVF1菌株为模型，研究了基于噬菌体的炭疽杆菌检测方法。李曼等人也RSVF1菌株为模型进行了杀灭试验的相关研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测炭疽芽孢杆菌的方法。

本发明提供了一种用于定量检测蜡样芽孢杆菌RSVF1的试剂盒，包括PlyG蛋白；所述试剂盒的用途为如下（a）或（b）：（a）定量检测蜡样芽孢杆菌RSVF1；（b）定量检测炭疽芽孢杆菌。

所述PlyG蛋白为如下（1）或（2）：

（1）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（2）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有裂解酶活性的由序列1衍生的蛋白质。

所述试剂盒还可包括luc蛋白。

所述luc蛋白为如下（3）或（4）：

（3）由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（4）将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有荧光素酶活性的由序列3衍生的蛋白质。

所述试剂盒还可包括D-荧光素。

所述试剂盒还可包括Profile-13560（10X）ATP微生物快速检测系统。

所述试剂盒还可包括记载有如下公式的载体：y=1.2587x-3.2879，x代表蜡样芽孢杆菌RSVF1总数以10为底的对数值，y代表发光值以10为底的对数值。

所述试剂盒还可包括记载有如下公式的载体：y=1.2587x-3.2879，x代表炭疽芽孢杆菌总数以10为底的对数值,y代表发光值以10为底的对数值。

本发明还保护以上任一所述的试剂盒在定量检测蜡样芽孢杆菌RSVF1中的应用。

应用以上所述试剂盒检测蜡样芽孢杆菌RSVF1时，每个反应可以采用50μl D-荧光素/荧光素酶混合溶液、50μl PlyG蛋白浓度为0.09mg/ml的PlyG蛋白稀释液和50μl待测菌液。

本发明还保护以上任一所述的试剂盒在定量检测炭疽芽孢杆菌中的应用。

应用以上所述试剂盒检测炭疽芽孢杆菌时，每个反应可以采用50μl D-荧光素/荧光素酶混合溶液、50μl PlyG蛋白浓度为0.09mg/ml的PlyG蛋白稀释液和50μl待测菌液。

本发明还保护所述PlyG蛋白在制备定量检测蜡样芽孢杆菌RSVF1的试剂盒中的应用。

本发明还保护所述PlyG蛋白在制备定量检测炭疽芽孢杆菌的试剂盒中的应用。

目前以ATP生物发光法定量检测细菌的研究往往采用细胞裂解液来裂解细菌从而释放ATP，大多不具有特异性和专一性。本发明以噬菌体裂解酶（PlyG）和荧光素酶（luciferase）为关键工具，以蜡样芽孢杆菌RSVF1为模型，建立了荧光发光值与细菌数量之间的线性关系且二者相关性显著（R²=0.9898）。本发明所建立的方法具备灵敏度高、特异性强、检测快速等优点，为特异性定量检测炭疽杆菌的研究及试剂盒开发奠定了基础。对特异定量检测炭疽杆菌的研究提供了有力的理论支持。

附图说明

图1为PCR扩增得到的PlyG、luc基因片段；M：BM2000DNA Marker；1：PlyG基因片段；2：luc基因片段。

图2为重组质粒pET22b-PlyG和重组质粒pET-luc的双酶切鉴定结果；M1：BM2000DNA Marker；1：重组质粒pET22b-PlyG的双酶切鉴定结果；2：重组质粒pET22b-luc的双酶切鉴定结果；M2:1kb Ladder DNA Marker。