[发明专利]一种检测抗肿瘤药物抑制肿瘤细胞和血小板粘附的活性的方法

权利要求书

1.一种检测抗肿瘤药物抑制肿瘤细胞和血小板粘附的活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、将荧光标记探针与富血小板血浆孵育，然后离心并吸取底层的血小板沉淀用血小板洗涤液洗涤，然后用血小板悬浮液重悬洗涤后的血小板，接着向血小板重悬液中加入CaCl₂，然后调整血小板浓度为10-100×10⁶个/mL以及CaCl₂浓度为1mM备用；

步骤2、将未经待检测抗肿瘤药物处理的肿瘤细胞设为对照组，经待检测的抗肿瘤药物处理后的肿瘤细胞为药物处理组，两组细胞分别经胰酶消化处理后用PBS洗涤，然后用肿瘤细胞悬浮液重悬得到对照组肿瘤细胞重悬液和药物处理组肿瘤细胞重悬液，调整两组肿瘤细胞密度为5×10⁶个/mL备用；

步骤3、将步骤2得到的两组肿瘤细胞重悬液分别和步骤1得到的血小板重悬液孵育，用多聚甲醛固定后于流式细胞仪上采用FL1通道检测肿瘤细胞荧光率获得药物处理组荧光率以及对照组荧光率；

将药物处理组荧光率和对照组荧光率进行统计学显著性差异分析得到检测结果。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述血小板洗涤液由以下方法制备获得：

3.60g NaCl，1.90g柠檬酸三钠，3.00g葡萄糖，溶于500ml双蒸水中，溶解后调整pH值至6.5即得。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述血小板悬浮液由以下方法制备获得：

血小板悬浮液原液5ml，1M HEPES125μL，20%葡萄糖250μL，1M MgCl₂50μL，0.05g BSA，用双蒸水定溶至50ml，溶解后调整pH值至7.4即得；

所述血小板悬浮液原液由8.00g NaCl，1.02g NaHCO₃，0.195g KCl溶于100ml双蒸水中配制而成。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述荧光标记探针为10μM的CFDA-SE、5-10μM的DiI、0.1-5μM的Calcein-AM或3μM的BCECF-AM。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述肿瘤细胞悬浮液由以下方法制备获得：

1M CaCl₂50μL，1M MgCl₂50μL，0.05g BSA，用RPMI-1640培养液定溶至50ml，溶解后调整pH值至7.4即得。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1和步骤3所述孵育的时间均为10-15min。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2所述PBS由以下方法制备获得：

称取8.00g NaCl，0.20g KCl，1.44g Na₂HPO₄，0.24g KH₂PO₄溶于1000ml双蒸水中，溶解后调整pH值至7.4，高压灭菌后即得。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2所述胰酶为质量百分比为0.25%的胰酶溶液。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞。

10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3所述肿瘤细胞重悬液和血小板重悬液的体积比为1:4。