[发明专利]一种99mTc标记Cys-Annexin V的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于单光子发射计算机断层（SPECT）显像技术领域，具体涉及一种^99mTc标记Cys-Annexin V的方法，以及^99mTc-Cys-Annexin V作为显像剂在检测细胞凋亡方面的应用。

背景技术

细胞凋亡（Apoptosis）又称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death，PCD），是细胞生命周期中的重要组成部分，是不同于坏死和意外死亡的由基因调控的细胞主动性死亡过程。细胞凋亡涉及一系列生物分子及细胞形态学的改变，其中，细胞膜脂质双层中的磷脂酰丝氨酸（PS）由膜内层翻转至外层，暴露于细胞表面，是细胞凋亡早期事件，发生在凋亡细胞形态学改变之前，也是凋亡级联反应的初始事件，作为凋亡细胞被吞噬细胞识别的标志，从而进一步引起胞浆的皱缩、染色质的浓集及核内DNA降解等。因此，外翻的PS是目前研究最多并最有希望和应用前景的凋亡检测靶点，可早期检测凋亡，具有较高的时效性，国内外常利用同PS特异性结合的药物来检测细胞凋亡。

膜联蛋白V（Annexin V，又称Annexin A5和AnxA5）是一种人体内源性蛋白，属于Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白家族，最早是从胎盘中分离出来，具有一些抗凝固及抗炎的作用，曾被作为一种抗凝剂研究。染色体定位分析显示，Annexin V是由位于人的第四条染色体4q26-q28上的Annexin V基因编码，含有319各氨基酸，包括70-80个氨基酸重复单元，分子量约为35kD。研究证实Annexin V能与PS特异性结合，亲和力高达10^-9mol/L。因此，以放射性核素标记Annexin V作为显像剂进行体内凋亡显像，实现细胞凋亡的活体无创显像，以实时监测体内凋亡的发生，成为监测活体细胞凋亡领域的研究重点，并已取得了较大进展。

Annexin V类显像剂的合成关键是放射性核素的标记，既要获得较高的放射化学纯度，同时又不能损伤Annexin V的结合活性。目前，以^99mTc标记Annexin V研究最多，^99mTc的优点在于半衰期为6h，可以及时显像，又使病人受的剂量较小，而且可以由Mo/Tc发生器方便的获得。然而，^99mTc直接标记Annexin V比较困难，标记率低，且在标记过程中会产生一些变性蛋白，造成肝脏的放射性摄取增加。因此，Annexin V的^99mTc标记以间接标记为主，常用的双功能鳌合剂有N-1-亚氨基-4-巯基丁基（Imino）、乙二胺半胱氨酸（EC）、二硫二氮（N₂S₂、又称BTAP）等，以肼基烟酰胺（HYNIC）最为多见，标记得到的^99mTc-HYNIC-Annexin V比活度较高，放射化学纯度大于90%，并且已经在凋亡动物模型中获得良好的评估。但是这些间接标记方法过程比较复杂，对技术条件要求严格，产物需纯化，尤其是不易制成药盒，临床使用受到一定限制。

最新的研究表明，Annexin V在基因重组表达中经结构修饰后可有利于用^99mTc直接进行标记。Annexin V的三维结构显示，其N-端和C-端都位于分子膜结合点的对面，因此在重组过程中对Annexin V的修饰并不影响重组蛋白在Escherichia colli的表达或折叠，也不改变其与膜PS结合的亲合性。如国外学者Tait JF等在N-端添加了7个氨基酸，其中含1-2个半胱氨酸残基，得到的三种突变体，分别命名为： Annexin V-116，Annexin V-117和Annexin V-118，国内学者华子春教授等在Annexin V的N端添加10个连续的组氨酸，命名为His10-Annexin V，这些重组的Annexin V变体与膜的结合活性跟天然Annexin V的相一致，并且这些重组的Annexin V变体经^99mTc标记后与^99mTc-HYNIC-Annexin V有比较相似的生物分布。这些表明对Annexin V的蛋白质工程改造是可行的。