[发明专利]一种花生种胚特异性启动子及其克隆和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，特别是植物转基因技术领域，具体涉及了一个新的花生基因的特异性启动子的克隆。

背景技术

种子在农业生产和国民经济中占有举足轻重的地位。统计数据表明，人类粮食的80%直接取自植物的种子，稻、麦等种子中富含淀粉，是人类赖以生存的主粮；大豆、花生、油菜、芝麻等种子的含油量高，是食用油的主要来源。种子中储存物质的多少，直接影响作物的产量。因此，提高粮食作物和油料作物产量的根本在于提高其种子中储藏物质的积累量。尽管常规育种技术所培育的优良作物品种，为解决世界粮食安全问题做出了重大贡献。然而，近20年来许多作物产量呈现徘徊局面，新育成品种在产量潜力上没有大的突破，常规育种技术在继续提高作物产量方面的潜力有限。因此，挖掘新的功能基因，利用转基因技术提高花生等作物产量及种子的含油量具有巨大的应用价值。

被子植物胚胎发育主要经历了3个相互交错的阶段：第一阶段为组织分化期，单细胞的受精卵经过多次分裂，并分化形成胚性组织和器官（即幼胚，从球形胚到心形胚期）；第二阶段为细胞伸长期（胚发育到鱼雷胚期），此时细胞分裂基本停止，以细胞膨大伸长和储藏物质积累为主要特征；第三阶段是成熟脱水期，种子开始脱水标志着胚胎发育成熟，种子经过脱水后代谢活动下降直至静止。对拟南芥种子发育表达谱研究的结果发现，大约289个种子特异性表达基因参与了胚胎发育，其中发现48个在不同发育阶段表达和定位在种子不同区域的转录因子基因对种子发育和储藏物质积累起重要的调控作用。对这些基因进行功能解析和表达调控研究具有重要意义。

花生作为重要的油料作物，不仅在国内农业经济中具有重要地位，而且在世界贸易中也具有举足轻重的作用。研究表明，不同植物种子储藏油脂的含量存在很大差异如主要油料作物油菜为28%-48%、大豆15%-22%、花生44%-54%、芝麻45%-57%，并且其主要脂肪酸组成也不同，油菜油中含有大量的芥酸（31-55%），其他含量较高的不饱和脂肪酸为油酸14-19%、亚油酸12-24%和亚麻酸1-10%；大豆油中含量最高的为亚油酸52-65%和油酸25-36%，并且棕榈酸（6-8%）、硬脂酸（3-5%）和亚麻酸（2-3%）也占有较大比例；花生种子脂肪酸组成主要是：棕榈酸，油酸和亚油酸，分别占总脂肪酸含量的10%、36-67%和15-43%，是除橄榄油外单不饱和脂肪酸油酸含量最高的。研究调控花生种子发育和储藏物质积累相关基因的表达对于通过基因工程改良其他作物具有一定指导意义。

目前在植物基因工程研究中，大多采用的是组成型启动子，如CaMV35S启动子、玉米Ubiquitin启动子等，这些启动子能够驱动外源基因在植物的所有组织和器官中高效表达，造成能量浪费，有些外源基因的表达还影响了植物的正常发育。为在确保植物正常生长的情况下，对目标性状进行转基因遗传改良，调控基因在一定发育时期和特定组织中表达非常重要。因此，寻找时空特异性表达启动子十分重要，也具有重要应用价值。

发明内容

基于上述的原因，本发明克隆获得了一个新的花生LEC1基因的启动子，该启动子于种子特定发育阶段驱动基因在种胚或胚乳中特异表达。本发明构建了该启动子及6个其5′端系列缺失的启动子驱动的GUS报告基因的植物表达载体，并转化拟南芥。实验表明，包括5′端非翻译区和其上游2228bp启动子驱动的GUS基因特异地在发育早期的种胚中表达；而缺失5′端975bp-2009bp的1254bp、935bp、721bp、617bp启动子驱动的GUS基因在根、茎、叶、花和发育早期的种子中均有表达，表明-2228bp至-1255bp区段不仅含有种子特异性表达的正调控元件，还包括抑制在其他组织中表达的负调控元件。缺失5′端1875bp的354bp启动子驱动的GUS基因在叶和发育早期的种胚中表达，在根中有少量表达，而在茎和花中没有表达。进一步缺失5′端2124bp的105bp启动子驱动的GUS基因仅在叶缘处表达，其余组织和器官都未检测到表达。因此，这一启动子的克隆和缺失分析对于研究植物种子发育和储藏物质积累，提高种子中储藏物质如淀粉、脂肪及蛋白的含量具有重要的理论意义和实际应用价值。

该启动子能驱动GUS基因在种子发育早期的种胚中特异表达。营养生长期的根、茎、叶中和进入生殖生长期的花中不表达。其基因序列如Seq ID No:4所示。