[发明专利]一种识别HIV-1受体结合表位的可溶性单链抗体的制备方法

权利要求书

1.一种识别HIV-1受体结合表位的可溶性单链抗体的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：

根据大肠杆菌密码子偏爱性将氨基酸序列翻译、优化成基因序列；

依据b12抗体轻链及重链基因序列设计并合成引物；

分别用对应引物从合成的轻链与重链基因上扩增出其可变区基因片段；

用重叠PCR的方法拼接得到完整的scFv基因序列；

将scFv基因序列和pET28a分别用NcoI和XhoI双酶切，连接电泳回收片段，获得表达质粒；

将重组质粒pET28-b12-scFv转化表达菌株BL21，在对数生长晚期加诱导剂，室温诱导表达后离心弃上清，沉淀用PBS缓冲液悬浮；

超声破碎菌体，分别收集上清和沉淀，10％SDS-PAGE分析蛋白表达及分布情况；

取固化Ni-NTA树脂装入层析柱中，用无菌水冲洗树脂，结合缓冲液平衡树脂，用超声波处理的细胞裂解液上清上柱后，依次用结合缓冲液、洗涤缓冲液分别洗柱，后用咪唑洗脱缓冲液洗脱非特异结合的杂蛋白，200mM-300mM咪唑洗脱并收集结合蛋白。

2.如权利要求1所述的识别HIV-1受体结合表位的可溶性单链抗体的制备方法，其特征在于，依据b12抗体轻链及重链基因序列设计并合成引物，轻链上游引物Ncob12L-F：

TTGTCCATGGAGATCGTGCTGACCCAATC，

下游引物G4SLight-R：

GCTCCCGCCACCTCCAGAGCCTCCGCCACCAGATGGTGCGGCCAC；

重链上游引物G4SH-F：

GGAGGTGGCGGGAGCGGCGGTGGAGGGTCTCAGGTGCAGCTGGTGCAG，

下游引物XhoH-R：TTGTCTCGAGAGAGGCGCTGCTCACGATCAC。

3.如权利要求1所述的识别HIV-1受体结合表位的可溶性单链抗体的制备方法，其特征在于，分别用对应引物从合成的轻链与重链基因上扩增出其可变区基因片段，在轻链上游引物5′端引入NcoI酶切位点，通过G4SLight-R和G4SH-F引物在轻链和重链之间引入三次重复的GGGGS间隔序列，在重链下游引物5′端引入XhoI酶切位点，最后通过重叠PCR的方法拼接得到完整的scFv基因序列，PCR产物进行NcoI和XhoI双酶切，回收目的基因片段就得到了b12的scFv基因，其线性结构表示为：scFv-VL-(G₄S)₃-VH。

4.如权利要求1所述的识别HIV-1受体结合表位的可溶性单链抗体的制备方法，其特征在于，将pET28a用NcoI和XhoI双酶切，电泳回收大片段。scFv基因片段与其在T4DNA连接酶的作用下16℃进行过夜连接，然后转化，筛选阳性克隆，提取质粒，进行酶切鉴定和测序。

5.如权利要求1所述的识别HIV-1受体结合表位的可溶性单链抗体的制备方法，其特征在于，将重组质粒pET28-b12-scFv转化表达菌株BL21(DE3)，37℃、250r/min过夜振荡培养，用过夜菌1∶50转接入LB培养基，37℃250r/min培养至OD₆₀₀＝0.6～1.0，大约需要2.5h，留取部分菌液做未诱导对照，其余加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，室温诱导4小时，诱导表达后离心弃上清，沉淀用PBS缓冲液悬浮。

6.如权利要求1所述的识别HIV-1受体结合表位的可溶性单链抗体的制备方法，其特征在于，用超声破碎仪在冰浴条件下超声破碎收集菌体10min，超声功率为30W，超声间隔时间为10s，裂解的菌液4℃12000rpm/min离心15min，分别收集上清和沉淀，10％SDS-PAGE分析蛋白表达及分布情况。

7.如权利要求1所述的识别HIV-1受体结合表位的可溶性单链抗体的制备方法，其特征在于，取1ml固化Ni-NTA树脂装入层析柱中，用无菌水冲洗树脂，结合缓冲液平衡树脂，用超声波处理的细胞裂解液上清上柱后，依次用结合缓冲液、洗涤缓冲液分别洗柱，后用50mM咪唑洗脱缓冲液洗脱非特异结合的杂蛋白，200mM-300mM咪唑洗脱并收集结合蛋白。