[发明专利]一种提高结球甘蓝离体再生效率的组织培养方法

说明书

技术领域

本发明属于植物生物技术和结球甘蓝栽培技术领域，尤其涉及一种提高结球甘蓝离体再生效率的组织培养方法。

背景技术

结球甘蓝属十字花科(Cruciferae)芸薹属（Brassica）的两年生草本植物，是我们重要蔬菜之一。两年生草本植物即当年经过营养生长期形成叶球。叶球通过贮藏越冬低温和来年长日照的影响，进入生殖生长期，抽苔开花结籽，完成生命过程。结球甘蓝具有适应性强、抗病、抗寒产量高、品质好，容易贮运、耐盐碱、栽培容易等特点。但在种质资源繁殖保存时受天气变化影响比较大，利用组织培养来保存可以减轻环境胁迫条件对结球甘蓝种质资源保存留种的不利影响。建立稳定的甘蓝组织培养再生体系是开展重要种质资源保护和基因工程的基础。甘蓝植株的再生能力强，但不同基因型、不同外植体及不同苗龄其再生频率有较大的差异。结球甘蓝离体再生的组织培养技术的研究有不少成功报道，但多数采用花药小孢子、不定芽叶片及无菌苗的子叶和下轴为外植体，在不同外植体取材部位、不同灭菌时间、不同激素配比等方面没有较具体的研究。本研究采用结球甘蓝嫩叶和带腋芽的嫩茎作为外植供体，建立了一种更为简单、更适合遗传转化的高频率植株再生体系。

发明内容

本发明提供了一种提高结球甘蓝离体再生效率的组织培养方法，建立了结球甘蓝高效再生体系。旨在解决不同外植体取材部位的消毒时间、不定芽和根诱导培养基的激素配比来改变再生系数低的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种提高结球甘蓝离体再生效率的组织培养方法，该组织培养方法包括以下步骤：

以选取离体再生诱导率高的外植体，在结球甘蓝抽薹开花末期取萌发的侧枝；

用7％的次氯酸钠进行灭菌，嫩叶和嫩茎灭菌时间分别为10min和20min；A3，叶片在诱导过程中先进行16-20h的黑暗培养，再进行光培养，培养15天后再进行转接一次；

嫩茎段的诱导，每个小茎段都带有腋芽进行诱导；

将诱导出的芽或丛生芽，进行继代增殖；不定芽长到3.0cm左右的时候，取生长健壮的单芽进行生根培养；选择根系发达的组培苗，先在室温下去掉封口膜进行练苗7d左右，把根部培养基清洗掉后，移栽在准备好的穴盘里。

进一步，该组织培养方法具体包括以下步骤：

第一、诱导

取材：在结球甘蓝抽薹开花末期取外植体，取萌发的无病斑和虫害的嫩侧枝，在枝条上部靠近心叶的第2-3片叶为嫩叶，取带柄嫩叶和去掉叶片的嫩枝上的嫩茎；

灭菌：将选好的田间外植体放在自来水下冲洗20-30min，再用蒸馏水冲洗3-4次后用吸水纸吸干水分；把嫩叶和嫩茎分开灭菌，各用75％的酒精消毒1min，再用7％Naclo进行消毒，嫩叶和嫩茎灭菌时间分别为10min和20min，消毒完后用无菌蒸溜水冲洗3-4次，接种在培养基上；

分化：灭菌后叶片切成0.5cm左右的方块，接种在MS+6-BA2mg.L^-1+NAA0.2mg.L^-1培养基上；片叶8-12片/瓶；处理10瓶，叶片的诱导要先进行16-20h的暗培养，在进行光培养，叶片在光培养15d后进行转接一次，把增大的叶片剪成小片培养，30d左右可以直接诱导出不定芽；把叶片去掉后的嫩茎段茎段灭菌后，切成带腋芽的茎段，切成0.5-1.0cm长的小段；每瓶接种5-10个小段；直接在光培养下培养，15d后就可看到诱导出的芽；

第二、继代增殖：将诱导出的芽或丛生芽，转接在MS+6-BA2mg.L^-1上，每瓶4-6个不定芽，25-30d左右进行转接一次，经过3-4代的培养，芽的倍数达200倍左右的增长；

第三、根的诱导：单芽或丛生芽生长到3.0cm左右的时候，取生长健壮的单芽进行生根培养，培养基MS+NAA0.3mg.L^-1，每个处理接10瓶，每瓶接5-6个单芽，15d后调查记载诱导生根率达到95％左右，25-30d根系健壮发达；

第四、移栽与定植：选择根系发达的组培苗，先在正常室温下去掉封口膜进行练苗7d左右，把根部培养基清洗掉后，移栽在准备好的穴盘里；基质选用育苗基质。采用潮湿的基质装盘，以用手一抓成团，一松及散为宜；移栽时为了使根系与栽培基质充分结合，移栽后把穴盘放在水池里，自然吸水，吸足水后放在阴凉处，1周左右即可成活，穴盘保持干干湿湿，成活率达100％。

进一步，外植体枝条最上部靠近生长点的第2、3片嫩叶，带叶柄取下，去掉叶片的侧枝取嫩茎。